1 2 3 Kỹ thuật sản xuất giống 4 Hải Sâm 5 6 I. Kỹ thuật tuyển chọn và nuôi vỗ thành thục hải sâm bố mẹ 1 1.1. Tuyển chọn, lưu giữ con bố mẹ 2 - Hải sâm cát được lựa chọn làm bố mẹ là những con hải sâm trưởng thành 3 khỏe mạnh, không trầy xướt, không bị bệnh. Chúng được đánh bắt từ tự nhiên 4 hoặc chọn lọc từ các ao nuôi thương phẩm. Kích cỡ tốt nhất nên lớn hơn 250 5 gam. 6 7 - Quá trình vận chuyển hải sâm bố mẹ có thể gây sốc dẫn đến hải sâm bị thải 8 nội tạng ra ngoài hoặc đẻ non nên quá trình vận chuyển phải hết sức cẩn thận. 9 tốt nhất vẫn là vận chuyển hở, để hải sâm sấp nước trong thùng xốp và giữ 10 nhiệt độ ổn định suốt quá trình vận chuyển. Vận chuyển hải sâm bố mẹ bằng 11 thùng xốp không nên để quá hai lớp hải sâm chồng lên nhau. 12 - Sau khi tuyển chọn và vận chuyển về trại, hải sâm được nuôi giữ trong ao 13 hoặc trong đăng có điều kiện nuôi như sau: 14 + Chất đáy: cát hoặc cát bùn 15 + Độ mặn: 25 – 35 ‰ 16 + Nhiệt độ: 25 – 31 độ C 17 + pH: 6,5 – 8,5 1 - Nuôi giữ hải sâm trong ao hoặc đăng biển có vị trí gần trại sản xuất. Tùy 2 theo công suất của trại mà diện tích đăng nuôi hoặc ao nuôi lớn hay nhỏ. Quá 3 trình nuôi vỗ trong đăng biển hoặc ao giúp cho hải sâm bố mẹ tăng trưởng 4 bình thường trong điều kiện nuôi ở mật độ thấp (<200g/m2), ít có sự cạnh 5 tranh về thức ăn. Trong quá trình nuôi, thường xuyên vệ sinh đăng cho nước 6 thông thoáng còn đối với nuôi ao thì quản lý môi trường ổn định, thay nước 7 thường xuyên đảm bảo hải sâm phát triển bình thường. 8 1.2. Nuôi vỗ thành thục hải sâm bố mẹ trong bể xi măng 9 - Nuôi vỗ thành thục hải sâm bố mẹ trong bể là yếu tố quyết định cho chủ 10 động trong sinh sản nhân tạo. Sau khi được nuôi vỗ trong bể, hải sâm bố mẹ 11 sẽ phát triển đồng đều về tuyến sinh dục và dễ dàng hơn khi kích thích. 12 - Bể nuôi vỗ bố mẹ cần có những điều kiện như sau: 13 + Diện tích: 15 – 20 m2 14 + Chất đáy: cát, độ dày 10cm 15 + Mực nước: 0,5 – 1,0m 16 + Độ mặn: 30 – 35 ‰ 17 + Nhiệt độ: 26 – 30 độ C 18 - Trước hết, chọn những cá thể khỏe mạnh, không trầy xước có kích cỡ trên 19 350 gam đưa vào nuôi vỗ thành thục. Bể nuôi vỗ thường là bể xi măng trong 20 nhà có mái che, thoáng mát. Cấp cát sạch vào bể độ dày 10cm cho hải sâm bố 21 mẹ vùi mình. Nước biển được bơm cấp trực tiếp vào bể hoặc qua hệ thống lọc 22 cát. 23 - Mật độ thả 1 con/m2, cho ăn bổ sung bằng thức ăn tôm dạng mịn CP 9.000 1 với 1 gam/m3. Thay nước hằng ngày vào buổi sáng nhằm cân bằng nhiệt độ 2 nguồn nước trong bể và nguồn nước thay, lượng nước thay khoảng 20% thể 3 tích. Thời gian cho 1 đợt nuôi vỗ thành thục hải sâm bố mẹ kéo dài trong 4 khoảng một tháng. 5 II. Kỹ thuật kích thích sinh sản 6 Do không phân biệt đực cái bằng hình thái ngoài nên mỗi đợt sinh sản chọn 7 khoảng 30 – 40 con hải sâm cát bố mẹ cho một lần kích thích. Các phương 8 pháp kích thích sinh sản được sử dụng trước đây khi chưa có kỹ thuật nuôi vỗ 9 thành thục hải sâm cát bố mẹ trong bể xi măng thường phức tạp và có độ tin 10 cậy thấp do hải sâm thành thục ngoài tự nhiên không đồng đều. Các phương 11 pháp kể đến như kích thích sốc nhiệt, phơi hải sâm trong bóng râm, dùng vòi 12 nước áp lực hay kết hợp với dung dịch tảo khô cho vào bể kích thích. Khi 13 dùng các phương pháp trên đều gây yếu con bố mẹ và làm bẩn trứng sau khi 14 hải sâm sinh sản. Do đó kỹ thuật kích thích cải tiến hiện nay là kích thích 15 nhiệt là chủ yếu. Các bước kích thích được mô tả như sau: 16 - Nhiệt độ bể kích thích được nâng lên cao hơn trong bể nuôi vỗ hải sâm bố 17 mẹ từ 3 – 5 độ C trước khi cho chúng vào bể kích thích. Trước đó, hải sâm bố 18 mẹ phải được vệ sinh kỹ bằng nước biển lọc sạch, nhốt và thay nước cho sạch 19 sẽ trước khi cho vào bể kích thích. 20 - Dùng một bể có đáy bằng phẳng, thể tích khoảng 1,5 – 2m3, cấp nước biển 21 sạch đã qua xử lý, lọc sạch qua túi siêu lọc 1µm vào khoảng 1/3 thể tích bể. 22 Dùng đèn hoặc máy nâng nhiệt để nâng nhiệt độ chênh lệch so với bể nuôi vỗ 23 hải sâm bố mẹ từ 3 – 5 độ C. Sau khi hải sâm đã nhả sạch cát và chất bẩn 24 trong ruột, tiến hành đưa hải sâm bố mẹ vào bể kích thích để cho sinh sản, thả 25 nhẹ hải sâm vào bể, sục khí nhẹ và đậy bạt để giữ nhiệt ổn định. 26 - Sau khi cho hải sâm bố mẹ vào bể kích thích, khoảng hai giờ sau khi kích 1 thích, con đực bắt đầu phóng tinh. Con đực thường phóng tinh trước con cái 2 khoảng 20 – 30 phút, có khi vài giờ, nó tiết ra một giải tinh trùng màu trắng 3 đục trong nhiều phút hoặc thậm chí hàng giờ để kích thích con cái đẻ. Khi con 4 cái đẻ, trứng phóng ra từ từ hoặc liên tục nhưng có lúc tăng hoặc giảm trong 5 một vài giờ, con cái có thể phóng trứng nhiều hơn một lần thường xảy ra đối 6 với cá thể thành thục có kích thước lớn. 7 - Quan sát, lựa chọn trong bể khoảng 3 – 5 con đực có chất lượng tinh trùng 8 tốt để lại và bắt bớt số con đực còn lại ra ngoài để hạn chế lượng tinh trùng dư 9 thừa. Con đực tốt là là những con có dải tinh trùng trắng đục phóng ra liên tục 10 nhưng tinh trùng không bị vón cục. Nếu để nhiều tinh trùng trong bể sẽ làm 11 bẩn nước, ảnh hưởng đến trứng. Hiện tượng đa tinh trùng trên trứng sẽ làm 12 giảm tỉ lệ thụ tinh, gây ảnh hưởng phát triển của trứng và tăng tỉ lệ dị hình của 13 ấu trùng. 14 - Sau khi toàn bộ con cái kết thúc phóng trứng thì bắt hết con bố mẹ ra ngoài, 15 tránh mất trứng khi hải sâm lọc nước. Nếu lượng trứng quá nhiều thì cấp thêm 16 nước cho giảm mật độ trứng, tránh mật độ quá dày gây vỡ trứng. Mật độ 17 trứng trong bể kích thích không nên quá 10 trứng/ml. 18 - Các thao tác như theo dõi và đếm có bao nhiêu con cái và con đực tham gia 19 phóng sinh sản là rất quan trọng trong việc tính toán cho đợt sinh sản kế tiếp, 20 xác định thời gian con cái phóng trứng để ước tính thời gian trứng nở. 21 - Trong trường hợp hải sâm bố mẹ không sinh sản, không nên tiếp tục dùng 22 các phương pháp khác. Chuyển hải sâm bố mẹ trở lại bể nuôi vố thành thục 23 để tiếp tục nuôi vỗ. 24 - Khi hải sâm sinh sản xong, chuyển chúng trở lại ao nuôi giữ để hải sâm 1 phục hồi cho nuôi tái thành thục, hải sâm bố mẹ thường tái thành thục trong 2 vòng từ 3 – 4 tháng. 3 III. Kỹ thuật thu và lọc trứng 4 - Quá trình thu và lọc trứng được tiến hành sau khi hải sâm bố mẹ ngưng 5 phóng tinh và trứng khoảng một giờ. Quan sát trên kính hiển vi, trứng đã bắt 6 đầu phân cắt. 7 - Đầu tiên, chuyển con bố mẹ nhẹ nhàng ra khỏi bể kích thích sang bể nước 8 sạch khác để tránh mất trứng trong trường hợp con cái tiếp tục đẻ trứng. Hút 9 trứng nhẹ nhàng ra khỏi bể kích thích bằng ống siphông qua khung lưới lọc 10 trứng kích cỡ mắt lưới từ 50 – 80µm đặt trong thau hoặc thùng xốp. Dùng 11 một vòi nước biển được lọc sạch cấp vào chậu lọc trứng nhằm rửa sạch bớt 12 tinh trùng và chất bẩn phát sinh trong quá trình hải sâm sinh sản. 13 - Giữ trứng trong khung lưới lọc lơ lửng bằng cách thỉnh thoảng khuấy nhẹ 14 nước bên ngoài khung lưới. Dùng một cốc thủy tinh hoặc ca nhựa có vạch 15 định lượng để thu trứng và đặt chúng vào xô sạch có sục khí nhẹ trước khi 16 chuyển trứng đến bể nuôi ấu trùng. Ngoài ra, có thể dùng xô nhỏ (10 lít) để 17 thu trứng thay vì hút trứng, cách làm tương tự theo các bước trên nhưng quá 18 trình thu trứng sẽ nhanh hơn. Tuy nhiên, cách thứ hai cần phải tốn công nhiều 19 hơn. 20 - Rửa sạch trứng và định lượng trứng trong xô trước khi chuyển vào bể nuôi 21 ấu trùng. Mật độ trứng trong xô không quá 100 trứng/ml, do đó không nên để 22 trứng quá mật độ trên trong trường hợp số lượng trứng nhiều hơn dự kiến. 23 Không nên để trứng trong bể kích thích qua đêm do môi trường nước trong bể 24 kích thích bị bẩn và mật độ trứng quá cao sẽ làm trứng bị lắng đáy. 25 IV. Kỹ thuật nuôi ấu trùng trôi nổi 26 4.1. Chuẩn bị bể nuôi 1 - Nước biển sạch qua lắng và lọc cát được cấp vào bể nuôi ấu trùng qua túi 2 lọc 1µm. Các yếu tố môi trường trong bể nuôi được duy trì ở độ mặn 30 – 35 3 ‰; nhiệt độ: 26 – 30 độ C; pH: 7,5 – 8,5. 4 - Bể nuôi ấu trùng được đặt trong nhà có phủ bạt hoặc mái che kín, đảm bảo 5 nhiệt dộ ổn định. Các bể thích hợp cho nuôi ấu trùng trôi nổi có dạng hình 6 vuông hoặc chữ nhật có thể tích từ 2 – 4m3. 7 4.2.Quản lý chăm sóc ấu trùng 8 - Mật độ ấu trùng ương nuôi thích hợp từ 300 – 500 ấu trùng/l, chế độ sục khí 9 24/24h. Trong 4 ngày đầu tiên, từ khi ấu trùng Auricularia xuất hiện, siphon 10 đáy và thay nước hàng ngày. Sau đó thay nước 2 ngày/lần. 11 - Quá trình siphon bằng cách tắt sục khí trong khoảng 10 phút trước khi hút 12 đáy, lúc này những ấu trùng khỏe nằm ở cột trên của tầng nước trong khi 13 những ấu trùng yếu và chết cùng với chất bẩn ở đáy bể, sẽ bị hút ra ngoài. Sau 14 khi siphon xong, mở sục khí lại bình thường. 15 - Thay nước 30% thể tích mỗi ngày. Sử dụng túi thay nước kích cỡ mắt lưới 16 100µm, túi thay nước đặt trong khung phao nổi đặ trong bể ấu trùng cố định, 17 ống thay nước đặt ở vị trí ở giữa nhằm tránh áp lực nước lên ấu trùng khi 18 chúng bám vào lưới. Khi thay nước, lượng nước đầu xả ra phải bằng đầu cấp 19 vào để đảm bảo cho nước không bị xáo trộn. Lưu tốc nước cấp vào phải ở 20 mức vừa phải (<20/phút), tránh ấu trùng bị ép vào khung lưới gây hao hụt ấu 21 trùng. 22 4.3. Chế độ cho ăn 23 - Khoảng 30 – 36h sau khi thụ tinh, trứng nở thành ấu trùng Auricularia. Lúc 24 này, bắt đầu cho ấu trùng ăn tảo đơn bào với mật độ 20.000 tb/ml và tăng dần 25 đến 40.000 tb/ml ở những ngày tiếp theo. Cho ấu trùng ăn tảo đơn bào cho 1 đến khi ấu trùng Auricularia vẫn còn bể nuôi. Cho ăn từ 2 – 3 lần /ngày sau 2 khi thay nước. 3 - Các kết quả nghiên cứu về dinh dưỡng cho ấu trùng cho thấy, tỉ lệ sống của 4 ấu trùng cao nhất khi kết hợp cho ăn tảo Chaetoceros mulleri và Rhodomonas 5 salina ở tỉ lệ bằng nhau hay tảo Isochrysis galbana trong những ngày đầu với 6 tảo Chaetoceros sp. và những ngày sau đó cũng với tỉ lệ bằng nhau. Tuy 7 nhiên, nếu trại sản xuất giống không có điều kiện nuôi nhiều loại tảo thì có 8 thể dùng tảo C. mulleri trong suốt giai đoạn nuôi ấu trùng trôi nổi vẫn hiệu 9 quả. Trong trường thiếu tảo tươi, thức ăn tổng hợp hoặc tảo khô Spirulina sp. 10 cũng có thể sử dụng cho nuôi ấu trùng nhưng hiệu quả thấp. 11 - Giai đoạn ấu trùng Doliolaria thường tìm kiếm giá thể chuyển bám đáy sang 12 ấu trùng Pentactula trong vài ngày. Nếu không có vật bám thì ấu trùng 13 Doliolaria sẽ tiếp tục trôi nổi và không xuống bám đáy. Do đó, vật bám thích 14 hợp phải được chuẩn bị khi thấy ấu trùng Doliolaria xuất hiện. 15 - Khi điều kiện thích hợp cho bám đáy, ấu trùng Doliolaria sẽ biến mất khỏi 16 cột nước trong khoảng 3 ngày. Lúc này, chúng biến thái qua giai đoạn ấu 17 trùng Pentactula và ấu thể. Tảo đa bào Chaetoceros sp. và tảo khuê dạng 18 chuỗi thích hợp cho ăn ở giai đoạn này với mật độ từ 2 – 3 lần so với giai 19 đoạn ấu trùng trôi nổi. 20 V. Kỹ thuật chuẩn bị vật bám 21 - Có nhiều phương cách để chuẩn bị vật bám khi ấu trùng Doliolaria đầu tiên 22 xuất hiện. Các phương pháp thường sử dụng trước đây như chuẩn bị giá bám 23 trong bể cấp bằng nước biển tự nhiên để gây nuôi thức ăn tự nhiên trên giá 24 bám hoặc nuôi tảo cấy từ phòng thí nghiệm cho vào bể đặt giá bám. Tuy 25 nhiên, các phương pháp trên đòi hỏi quá trình chuẩn bị phức tạp và thường đi 26 kèm với sự nhiễm bẩn, tảo tạp từ môi trường từ nguồn nước biển không được 1 lọc sạch, chi phí cao và không chủ động trong sản xuất. Để tránh sự nhiễm tạp 2 vào bể nuôi ấu trùng như các loài địch hại như copepods, nguyên sinh động 3 vật, giun… phương pháp cải tiến nhất đơn giản và hiệu quả hiện naylà chuẩn 4 bị vật bám bằng giá thể được quét bằng tảo khô thay vì các phương pháp cũ 5 nêu trên. 6 - Các giá thể thích hợp sử dụng làm vật bám là các loại tôn nhựa PVC. Cắt 7 tấm tôn PVC thành những giá thể nhỏ thường có kích thước 40 x 50cm, vệ 8 sinh sạch và lau khô. Pha tảo khô (Spirulina sp.) thành dung dịch dạng sệt khi 9 pha với nước tỉ lệ 1g/ml. Dùng bàn chải mềm quét một mặt của vật bám với tỉ 10 lệ 1 – 2g/m2 diện tích vật bám. Phơi khô và cuộn tròn (hở) chúng lại bằng dây 11 buột chặt với phần quét tảo hướng về phía bên trong. 12 - Khi lượng ấu trùng Doliolaria trong bể đạt khoảng 2/3 tổng số ấu trùng thì 13 bắt đầu thả vật bám vào bể. Sau khi bỏ vật bám vào khoảng 4 giờ sau thì thay 14 nước hoàn toàn nhằm loại bỏ lượng tảo khô dư thừa trên các tấm vật bám hoà 15 tan trong bể nuôi. 16 - Số lượng vật bám cho mỗi lần thả là 30 tấm/m3 nước. Tuy nhiên, cũng còn 17 tùy thuộc vào lượng ấu trùng, đảm bảo không quá 1 con/cm2 vật bám. 18 VI. Kỹ thuật ương nuôi con giống 19 Khoảng 25 – 35 ngày tuổi, con ấu thể đạt kích cỡ khoảng 2 – 5mm thí tiến 20 hành chuyển ra giai lưới ương lên con giống. Chuyển con giống từ trại giống 21 ra ương trong hệ thống giai lưới ương được cắm trong ao. 22 6.1. Lựa chọn ao ương 23 Ao ương phù hợp cho ương giống là ao nằm ở vùng hạ triều dễ dàng thay 24 nước theo thuỷ triều có nguồn thức ăn tự nhiên với nhiều mùn bã hữu cơ và 25 vật chất lơ lửng, đảm bảo các điều kiện sau: – Chất đáy: cát hoặc cát bùn – Độ 1 mặn: 25 – 35 ‰ – Nhiệt độ: 25 – 31 độ C – pH: 6,5 – 8,5 2 6.2. Thiết kế giai lưới 3 Giai lưới có kích cỡ mắt lưới từ 0,6 – 0,8mm được thiết kế dạng hình chữ 4 nhật có chiều dài hẹp. Kích thước giai lưới chiều rộng x chiều dài x chiều cao 5 tương ứng với 1,2 x 2,0 x 1,2m. Phần giai lưới ngập trong nước không quá 6 1m, mỗi giai được cố định bởi 4 – 6 cọc tre hoặc gỗ cả mép trên lẫn mép dưới 7 của giai lưới để hải sâm giống không bò ra ngoài. 8 6.3. Chuẩn bị ao và giai ương 9 Trước khi chuyển con giống ra ương, cải tạo, diệt tạp ao ương trước khi cắm 10 giai ương. Ao phải được bơm, phơi khô và diệt địch hại (cua, ghẹ, cá dữ, ốc 11 ký cư…). Cắm giai lưới trước khi thả con giống từ 3 – 4 ngày để thức ăn tự 12 nhiên phát triển trong giai lưới đảm bảo thức ăn hải sâm giống phát triển . 13 6.4. Quản lý chăm sóc 14 - Mật độ thả ương giống thích hợp từ 600 – 800 con ấu thể/m2 giai lưới. Che 15 lưới mát trên mặt giai lưới trong tuần thả đầu tiên, sau đó giảm dần độ che ở 16 các tuần kế tiếp. 17 - Trong quá trình ương giống, thay nước càng nhiều càng tốt, vệ sinh định kỳ 18 giai lưới bên ngoài bằng bàn chà mềm 3 ngày/lần tạo cho nước thông thoáng, 19 loại bỏ phân hải sâm ra ngoài và tạo điều kiện để thức ăn tự nhiên phát triển 20 trong giai ương. 21 - Kiểm tra giai ương thường xuyên để bắt địch hại như tôm, cua… nhảy hoặc 22 bò vào giai gây hao hụt hải sâm giống. Bố trí hệ thống giàn đập nước để đảo 23 nước trong điều kiện thời tiết bất lợi như trời mưa lớn làm giảm độ mặn, phân 24 tầng nước trong ao và giai lưới gây nóng đáy và thiếu ôxy. 25 [...]... gần trại giống thì không cần đóng túi bơm ôxy, chuyển trực tiếp ra 17  ao Trong trường hợp ao ương nằm xa khu trại sản xuất giống thì dùng túi 1  nilon bơm ôxy để đảm bảo sức khỏe cho con giống khi chuyển ra ao ương 2  Quá trình vận chuyển con ấu thể phải lưu ý tránh gây sốc về nhiệt độ, độ mặn 3  và độ xóc trong khi vận chuyển 4  7.2 Kỹ thuật thu và vận chuyển con giống cỡ lớn 5  - Khi con giống trong... hành thu 6  giai để vận chuyển con giống đến nơi tiêu thụ 7  - Dùng rổ hoặc vợt thưa, đảm bảo con giống không bị lọt để thu giống Nhất 8  giai lưới lên khỏi mặt nước và dùng rổ thu toàn bộ hải sâm giống trong giai 9  Lựa chọn những con giống có trọng lượng lớn hơn 2 gam để chuyển vào một 10  giai mới hoặc vào bể một ngày trước khi vận chuyển đến nơi tiêu thụ Số 11  giống nhỏ hơn sẽ được chuyển ương... nuôi con giống kéo dài khoảng 30 – 45 ngày tuỳ thuộc vào 2  điều kiện của mỗi ao ương Kiểm tra và san thưa con giống qua giai ương mới 3  khi thấy tăng trưởng của chúng chậm lại Trong trường hợp lưu giữ con giống 4  ở mật độ cao, có thể bổ sung thêm thức ăn tôm dạng mịn CP 9.000 với lượng 5  1g/m2, nhưng thường rất dễ gây bẩn đáy 6  VII Kỹ thuật thu và vận chuyển con giống 7  7.1 Kỹ thuật thu con giống. .. hợp nơi tiêu thụ ở gần, ít hơn 2 giờ vận chuyển thì áp dụng 13  vận chuyển con giống phương hở bằng thùng xốp Cấp nước biển sạch, sấp bề 14  mặt con giống trong thùng vận chuyển để giảm xóc Mật độ vận chuyển càng 15  thấp càng an toàn, cho phép không quá 2.000 con/ thùng (cỡ 40 x 60cm) 16  - Đối với trường hợp vận chuyển con giống xa trên hai giờ thì áp dụng 17  phương pháp vận chuyển kín bằng túi nilon... nhỏ cỡ 2 – 5mm 8  - Dùng bàn chải mềm và vòi nước biển sạch áp lực để đẩy ấu thể bám trên 9  thành bể và vật bám xuống đáy bể Số ấu thể bám trên vật bám thì dùng tay 10  lắc nhẹ trong nước cho chúng rời khỏi vật bám Chuẩn bị lưới thu cỡ nhỏ từ 11  600 – 800µm đặt ở lù xả đáy của bể để thu con ấu thể, dùng vòi nước xịt nhẹ 12  nhàng cho con ấu thể ra ngoài lù xả để thu giống 13  14  - Đặt lưới thu trong... kín bằng túi nilon bơm ôxy Cấp nước biển sạch vào 18  1/3 túi, mật độ cho 1 túi nilion cỡ 10 x 50cm không quá 500 con/túi Trong 19  quá trình vận chuyển giữ nhiệt độ ổn định không quá 30 độ C, đặt túi hải sâm 20  cố định trong thùng xốp nhằm giảm xóc trong quá trình vận chuyển 21  . 3 Kỹ thuật sản xuất giống 4 Hải Sâm 5 6 I. Kỹ thuật tuyển chọn và nuôi vỗ thành thục hải sâm bố mẹ 1 1.1. Tuyển chọn, lưu giữ con bố mẹ 2 - Hải sâm. 23 hải sâm bố mẹ từ 3 – 5 độ C. Sau khi hải sâm đã nhả sạch cát và chất bẩn 24 trong ruột, tiến hành đưa hải sâm bố mẹ vào bể kích thích để cho sinh sản,