Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 8 Đại học Đà Nẵng năm 2012 1 NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ TẠO DÒNG GEN MÃ HÓA CELLULASE TỪ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS RESEARCH AND CLONING A GENE ENCODING CELLULASE FROM BACILLUS SUBTILIS SVTH: Đặng Thị Châu Thu Lớp 07SH, Khoa Hóa, Trường Đại học Bách Khoa, Đại học Đà Nẵng GVHD: Th.S Ngô Thái Bích Vân Khoa Hóa, Trường Đại học Bách Khoa, Đại học Đà Nẵng TÓM TẮT Enzyme cellulase được ứng dụng nhiều trong môi nông trường, nông nghiệp, công nghiệp, y học,….Tuy nhiên tại Việt Nam việc sản xuất chế phẩm enzyme này vẫn chưa thực sự hoàn thiện. Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành tạo dòng đoạn gen mã hóa endo-1,4-beta- glucanase thuộc hệ enzyme cellulase từ vi khuẩn Bacillus subtilis. Đoạn gen sau khi tạo dòng thành công được bước đầu biểu hiện trong chủng E.coli BL21(DE3) cảm ứng bằng IPTG 1mM. Hoạt tính của enzyme được kiểm tra bằng phương pháp thủy phân trên môi trường thạch chứa CMC (carbo-metyl-cellulose) 1% và phương pháp đường khử Bermeld. Đồng thời chúng tôi kiểm tra kích thước của enzyme mục tiêu bằng điện di SDS-PAGE. Kết quả này sẽ làm nền tảng cho việc sản xuất chế phẩm enzyme cellulase phục vụ trong nhiều ngành công nghiệp sau này. ABSTRACT Cellulase enzyme plays a critical role in many fields such as agriculture, industry, medicine, etc. However, production of this enzyme still haven't been completed. In this study, we carried out cloning the gene endo-1,4-beta-glucanase which is coding for the biosynthesis of cellulose on the Bacillus subtilis DNA. The cloning gene is represented on the expression system of E.coli BL21(DE3) and induced with 1mM IPTG. The producing enzyme is test for activity on the medium with CMC (carbo-metyl-cellulose) 1% and the reducing sugar Bermeld. As the same time, we check the size of the target enzyme by SDS-PAGE. This result will base for the manufacturing cellulase which is using for many industry application. 1. Đặt vấn đề Enzyme cellulase được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: nông nghiệp, công nghiệp, y học, môi trường, …. Trong nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm: enzyme này được dùng để chế biến thức ăn cho vật nuôi, cải thiện giá trị dinh dưỡng của thức ăn gia súc, gia cầm. Trong y học: cellulase được dùng để trích ly các chất từ cây thuốc, tạo nên những bước phát triển vượt bậc cho ngành công nghiệp dược phẩm. Ngoài ra, cellulase còn được ứng dụng trong quy trình tạo cồn sinh học hướng đến việc tạo ra nguồn nhiên liệu thay thế dần cho nguồn dầu mỏ đang ngày càng cạn kiêt [4]. Các chủng vi khuẩn như Bacillus subtilis, vi nấm như Tricodeman,…có khả năng sinh enzyme cellulase mạnh. Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành thu nhận và tạo dòng gen mã hóa cho endo-1,4-betaglucanase từ vi khuẩn Bacillus subtilis. Đề tài nếu được khai thác triệt để sẽ là bước tiến quan trọng, là cơ sở để hướng đến việc thu nhận và sản xuất chế phẩm enzyme cellulase thương mại với giá thành hợp lý. 2. Kết quả nghiên cứu và khảo sát Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 8 Đại học Đà Nẵng năm 2012 2 2.1. Kết quả thu nhận DNA bộ gen từ Bacillus subtilis Để thu nhận gen mã hóa cho enzyme endo-1,4-betaglucanase, chúng tôi sử dụng bộ gen của vi khuẩn Bacillus subtilis làm mạch khuôn. Theo các nghiên cứu trước được tiến hành tại phòng thí nghiệm công nghệ sinh học – Đại học Bách Khoa Đà Nẵng chủng vi khuẩn này đã được chứng minh có khả năng sinh enzyme cellulase mạnh. Do vậy, đầu tiên chúng tôi tiến hành tách chiết DNA bộ gen bằng phương pháp SDS-kiềm. Kết quả thu được điện di trên gel agarose 1% như sau: Hình 1 Kết quả tách DNA bộ gen Bacillus subtilis Giếng M: Thang DNA 100bp (Biorad) Giếng 1: DNA bộ gen Bacillus subtilis 2.2. Kết quả nhân bản đoạn gen endo-1,4-betaglucanase Trên cơ sở DNA thu được, chúng tôi tiến hành phản ứng OE PCR (overlap extension PCR) để thu nhận đoạn gen mong muốn . Phản ứng PCR đầu được tiến hành hai phản ứng với hai cặp mồi F1 và R1, F2 và R2 với chu trình nhiệt: 95 0 C trong 5 phút, 94 0 C trong 1 phút, 52 0 C trong 45 giây, 72 0 C trong 1 phút 30 giây, 72 0 C trong 10 phút (lặp lại 35 chu kì) để thu được hai đoạn gen có kích thước khoảng 900 bp, 700 bp. Phản ứng PCR thứ hai sử dụng sản phẩm của hai phản ứng PCR đầu làm nguyên liệu (template) chạy với chu trình nhiệt như trên 25 chu kì sau đó bổ sung mồi F1&R2 chạy tiếp tục 30 chu kì với mục đích thu được đoạn gen có kích thước 1600 bp [2]. Mồi F1, R2 được thiết kế có vị trí cắt của enzyme BamHI và XhoI tương ứng. Các kết quả PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% như sau: A B Hình 2 Kết quả PCR đoạn gen endo-1,4-glucanase Giếng M: Thang DNA 100bp (Biorad) Giếng 1A: Đoạn gen thứ nhất 900 bp Giếng 2A: Đoạn gen thứ hai 700 bp Giếng 1B: Đoạn gen endo-1,4-betaglucanase 1600bp Từ kết quả điện di cho thấy chúng tôi đã thu được đoạn gen endo-1,4-betaglucanase hoàn chỉnh với kích thước khoảng 1600 bp. Đoạn gen thu được sẽ tiếp tục thực hiện quy trình dòng hóa vào Escherichia coli DH5α. Từ kết quả điện di cho ta thấy chúng tôi đã thu nhận được DNA bộ gen Bacillus subtilis nguyên vẹn. DNA có thể tiếp tục sử dụng để thực hiện nhân bản thu gen mục tiêu. 1000 bp Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 8 Đại học Đà Nẵng năm 2012 3 2.3. Kết quả tạo dòng và kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET28a(+)endo-1,4-betaglucanase 2.3.1 Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp pET28a(+)endo-1,4-betaglucanase vào Escherichia coli DH5α Trong đề tài này chúng tôi chọn plasmid pET28a(+) làm vector mang gen mục tiêu với hai vị trí cắt của enzyme BamHI và XhoI tại vị trí tạo dòng đa bội, đoạn gen đã được thiết kế có mang vị trí cắt của hai enzyme này. Do vậy, đầu tiên chúng tôi xử lý plasmid pET28a(+) và đoạn gen endo-1,4-betaglucanase bằng hai enzyme cắt hạn chế BamHI và XhoI. Phản ứng cắt được thực hiện ở 37 0 C trong 4 giờ. Sau đó thực hiện phản ứng nối tạo vector tái tổ hợp nhờ enzyme nối T4 ligase ở điều kiện nhiệt độ 4 0 C qua đêm. Sản phẩm nối được hóa biến nạp vào tế bào E.coli DH5α sau đó được sàng lọc trên môi trường LB có bổ sung kanamycin (30 µg/ml) ở 37 0 C, qua đêm. A B C Hình 3 Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào Escherichia Coli DH5α (hình A). Kết quả biến nạp plasmid pET28a(+) vào Escherichia Coli DH5α – chứng dương (hình B). Kết quả cấy trải Escherichia coli DH5α khả nạp – chứng âm (hình C). Kết quả hình 3 cho thấy chúng tôi đã biến nạp thành công vector tái tổ hợp vào chủng DH5α. Sau bước này, chúng tôi sẽ tiến hành sàng lọc các khuẩn lạc tại đĩa thạch hình A để thu được chắc chắn dòng có chứa vector tái tổ hợp. 2.3.1. Kết quả sàng lọc chủng Escherichia coli DH5α có mang vector tái tổ hợp pET28a(+)endo-1,4betaglucanase Để chọn ra được khuẩn lạc có chứa vector tái tổ hợp pET28a(+)endo-1,4- betaglucanase. Chúng tôi tiến hành sàng lọc bằng phương pháp tách chiết DNA tổng số [3]. Hình 4 Kết quả sàng lọc chủng DH5α mang vector tái tổ hợp Giếng M: Marker 100 bp (Biorad) Giếng 1,3,4,5: Các dòng DH5α mang plasmid pET28a(+) Giếng 2: Dòng DH5α mang plasmid tái tổ hợp pET28a(+)endo-1,4-betaglucanase 2.3.2. Kết quả quy trình tách thu plasmid tái tổ hợp và kết quả cắt kiểm tra plasmid tái tổ Qua kết quả điện di ở trên, tại giếng 2 là dòng có mang plasmid tái tổ hợp vì kích thước plasmid tái tổ hợp khoảng 7 kb do vậy sẽ nằm ở trên so với vạch plasmid bình thường có kích thước 5,4 kb. Từ đó chúng tôi sẽ thu nhận được dòng cần tìm tại giếng số 2. Dòng này sau đó sẽ được nuôi tăng sinh trên môi trường LB/Kanamycin để tiến hành tách thu nhận plasmid tái tổ hợp. Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 8 Đại học Đà Nẵng năm 2012 4 hợp pET28a(+)endo-1,4-betaglucanase: Sau khi đã xác định chính xác dòng DH5α có mang vector tái tổ hợp. Chúng tôi tiến hành nuôi tăng sinh khuẩn lạc và thực hiện quy trình tách thu nhận plasmid tái tổ hợp. Tiếp theo, chúng tôi thực hiện phản ứng cắt plasmid tái tổ hợp thu được bằng enzyme BamHI và XhoI. Phản ứng cắt được thực hiện ở 37 0 C trong 4 giờ. Sản phẩm tách thu nhận plasmid và sản phẩm phản ứng cắt kiểm tra được điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Hình 5 Kết quả điện di kiểm tra plasmid tái tổ hợp và cắt plasmid tái tổ hợp Giếng M: Thang DNA 100bp (Biorad) Giếng 1: Kết quả sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp Giếng 2: Kết quả sản phẩm cắt mở vòng plamisd pET28a(+) 2.4. Kết quả thử hoạt tính enzyme endo-1,4-betaglucanase thu được 2.4.1. Kết quả định tính khả năng sinh enzyme endo-1,4-betaglucanase Để gen mục tiêu được biểu hiện, chúng tôi tiến hành hóa biến nạp vector tái tổ hợp trên vào chủng biểu hiện E.coli BL21(DE3). Chủng này được cảm ứng bằng IPTG 1,5mM ở 37 0 C trong 4h. Khả năng thủy phân enzyme được kiểm tra bằng phương pháp cấy chấm điểm trên môi trường thạch CMC 1%. Hình 6 Kết quả định tính khả năng sinh enzyme celulase của EcoliBL21 2.4.2. Kết quả xác định hoạt độ enzyme sinh ra bằng phương pháp đường khử Ngoài định tính khả năng sinh enzyme của chủng tái tổ hợp. Chúng tôi sử dụng phương pháp đường khử của Bermeld để định lượng hoạt tính enzyme. Trước tiên chúng tôi xây dựng đồ thị tương quan giữa nồng độ glucose chuẩn và giá trị OD540nm. Dựa vào phản ứng của thuốc thử DNS với các dung dịch chuẩn glucose, cường độ màu biến đổi được xác định bằng phương pháp đo mật độ quang ở bước sóng OD 540nm . Từ giá trị OD 540nm ở các nồng độ khác nhau, chúng tôi xây dựng được đồ thị thể hiện sự tương quan giữa nồng độ glucose và giá trị OD 540nm Như vậy plasmid sau khi xử lý bằng enzyme cho hai vạch tương ứng với vạch phía trên là plasmid pET28a(+) có kích thước 5,4 kb, vạch ở dưới là đoạn chèn có kích thước khoảng 1600 bp. So với plasmid pET28a(+) đã được cắt mở vòng ở giếng 3 thì vạch plasmid sau khi cắt ở giếng 2 có kích thước tương đương. Điều đó chứng tỏ gen mục tiêu đã được gắn chèn vào plasmid pET28a(+). Từ kết quả thu được chúng tôi kết luận vector tái tổ hợp pET28a(+)endo-1,4-betaglucanase khi biến nạp vào chủng E.coliBL21(DE3) có hoạt tính cellulase. Chúng tôi sẽ tiếp tục sử dụng chủng này để thực hiện các thử nghiệm kiểm tra hoạt tính enzyme cellulase. Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 8 Đại học Đà Nẵng năm 2012 5 Hình 7 Đồ thị thể hiện tương quan giữa nồng độ glucose chuẩn và giá trị mật độ quang 540nm Từ kết quả OD của mẫu thử có enzyme cellulase (OD 540nm = 0,306), mẫu thử không có enzyme (OD 540nm = 0,015) và đường chuẩn, chúng tôi nhận thấy hoạt độ của enzyme cellulase của mẫu thu được là: x = 242,5 µg/ml. Điều đó chứng tỏ dịch enzyme thu được có hàm lượng enzyme cellulase cao nên khả năng thủy phân đường tốt. 2.4.3. Kết quả điện di SDS-PAGE mẫu enzyme thu được Hệ enzyme cellulase có trọng lượng khoảng 50-55 kDa, để đánh giá kết quả tạo dòng chúng tôi tiến hành điện di dịch enzyme sau khi tủa bằng phương pháp điện di SDS- PAGE với gel polyacrylamide 10%. Kết quả cho hình ảnh sau: Hình 8 Kết quả điện di SDS-PAGE dịch enzyme cellulose sau khi tủa bằng acetone Giếng M: Thang chuẩn protein(Fermentas) Giếng 1,3 : Dịch enzyme thu được từ E.coliBL21(DE3) Giếng 2,4: Dịch enzyme cellulose thu được từ dòng E.coliBL21(DE3) biểu hiện Từ kết quả thu được cho thấy sau khi biểu hiện chúng tôi thu được phần lớn là hệ enzyme có kích thước nằm trong khoảng 50 – 55 kDa phù hợp với kích thước của hệ enzyme cellulase. Vậy chúng tôi đã tạo dòng và bước đầu biểu hiện thành công đoạn gen mã hóa enzyme cellulase trong chủng E.coliBL21(DE3). 3. Kết luận Qua quá trình nghiên cứu chúng tôi đã tạo dòng thành công đoạn gen mã hóa enyme cellulase từ Bacillus subtillis trong E.coliBL21(DE3). Bằng các kỹ thuật sinh học phân tử chúng tôi đã xác định đoạn gen tạo dòng là đoạn gen mong muốn. Đồng thời, chúng tôi tiến hành thử hoạt tính của đoạn gen được tạo dòng bằng các phương pháp cấy chấm điểm, đường khử để bước đầu xác định hoạt tính của chủng tạo thành và kiểm tra kích thước enzyme thu được bằng điện di SDS-PAGE. Những thử nghiệm trên là cơ sở để tiếp tục tiến hành khảo sát các yếu tố nhiệt độ, môi trường, nồng độ chất cảm ứng,… sao cho thu được lượng enzyme cellulase là lớn nhất. Nhằm mục đích phục vụ cho việc tiến hành sản xuất chế phẩm enzyme cellulase thương mại phục vụ cho thị trường. Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 8 Đại học Đà Nẵng năm 2012 6 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Trần Thị Hòa, Phạm Lê Thanh Mai, Hồng Phước Toàn, Nguyễn Quốc Bình, “Tổng hợp các cDNA mã hóa hai enzyme endoglucanase 1,2 của Trichoderma Reesei bằng phương pháp overlap extension PCR (OE-PCR)”, Trung tâm Công nghệ sinh học thành phố Hồ Chí Minh. [2] Heckman, K.L and L.R Pease (2007), “Gene splicing and mutagenesis by PCR-driven overlap extension”, Nat Protoc, 2(4):924-32 [3] GUO Xu-Dong, MAO Shu-Yan, HOU Dong-Xia, BOU Shorgan, “A rapid method for Preparation of plasmid DNA for secreening recombinant clones”, Chinese jounarl of Biotechnology, (2007) 23(1), 176-178. [4] Wang Li, Wei-Wei Zhang, Ming-Ming Zang, Yu-Lin Chen, “Cloning of Thermostable Cellulase Gene from newly isolated Bacillus subtilis and its expression in Escherichia coli”, Mol Biotechnol, (2008) 40:195-201 [5] Deliang Yang, Haibo Weng, Minge Wang, Weihua Xu, Yaozhao Li, Huiling Yang, “Cloning and expression of a novel thermostable cellulose from newly isolated Bacillus subtilis strain I15”, Mol Biol Rep, (2010)37:1923-1929 DOI 10.1007/s11033- 009-9635-y. . tập Báo cáo Hội nghị Sinh vi n Nghiên cứu Khoa học lần thứ 8 Đại học Đà Nẵng năm 2012 1 NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ TẠO DÒNG GEN MÃ HÓA CELLULASE TỪ VI KHUẨN. quả thu nhận DNA bộ gen từ Bacillus subtilis Để thu nhận gen mã hóa cho enzyme endo-1,4-betaglucanase, chúng tôi sử dụng bộ gen của vi khuẩn Bacillus subtilis