t bin mn 4977 bp ca DNA ty th  bi tr   i hc Khoa hc T  Lu ThS.  Sinh hc thc nghim; : 60 42 30 ng dn: PGS.TS. Trnh H o v: 2012 Abstract. Tng quan v DAN ty tht bin DNA ty th (MT DNA) ch th sinh hc ti i trc tr vt bin mt n 4977 BP xy ra trong DNA ty tht bin mn 4977    DNA ty th  bi tru: t DNA tng s t t bin mn 4977 bp mtDNA bng PCR; x n phm PCR khu t bin mn 4977 bp mtDNA bng      ch sn ph     n di kim tra sn ph;  t qu o lum bnh h bi trt qu t DNA tng s t m i trt qu khut bin mn 4977 bp ca DNA ty th bng k thut PCR; kaats qu x n phm PCR s dng cp mi 4977-2 bng Enzyme gii hn; kt qu gi sn phm PCR ct bin mn 4977 bp ct bin mn 4977 bp ca DNA ty th m bnh ha bi tr m Heteroplasmy xy ra trong DNA ty th. Keywords. Sinh hc thc nghim; DNA; B   ;   i trc ; Di truyn h; t bin gen Content Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1 DNA TY THỂ Ty th  y trong gt c   . S ng ca ty th trong mi t  m36]. Ty th   ng -- b ca ty th c bao bc bi hai lu to bp phospholipid a cht n i  t ph protein c n ca 18]. Trong ty th, ARN chim khong 0,5-3%, DNA khong 0,024  0,34% [18]. Ty th p ca t n sinh ra ATP, cung cng cho t  Ty th  gen c l   sinh sn b m   con [3]. 1.1.1. Cấu trúc genome ty thể DNA ty th , mt ty th cha khong 10 bn sao ca mtDNA, i t ng 100  10.000 b mtDNA si c khong 15.000  17.000 bp.  c 16.569 cp n b i n i nh. Trong s 37 gen p t  7]. 1.1.2. Cơ chế di truyền của hệ gen ty thể. c di truyn t m (di truy) [25]. 1.1.3. Các rối loạn ty thể . Ci lon ty th (hay bnh do ty th t bin  c gen ty th. Mt s ri lon ty th ch n mng ri lon n rt nhim ni tri.  khonh di truyu h do ty th quynh do ri loc biu hin rng. [11]. 1.2. ĐỘT BIẾN DNA TY THỂ (MT DNA)  CHỈ THỊ SINH HỌC TIỀM NĂNG TRONG UNG THƢ. T l t bin ca mtDNAso vi t l t bin c(khong 17 ln) [11]. 1.2.1. Các đột biến trên mtDNA Pt bit bit bin mn, p xp li. [36]. ng, tt c  mtDNA ging ht nhau (homoplasmy)t bi hi cng ch n mt s b  mtDNA (heteroplasmy).                               .                                                 [32]. t bin bnh cn phu k v  t binh (t l heteroplasmy) nha bnh, u tr hiu [17]. 1.2.2. Mối liên hệ của đột biến mtDNA với bệnh ung thƣ t bic ghi nhng b  c bit bit bim ng gt bin thay th, mt hot s t bin   thiu   n lp nh vi v tinh c         [12,14]. Nht biy  tiu phn ca phc h I, phc h III, phc h t c t bi y, nht bin mtDNA trou khin D y ra  bng trng,    [33].   c tiu lo c kt lun nh trong s  p ca  sa cha DNA b sai h t bin  mtDNA. Theo tht bi    trnh [24]. 1.2.3. Mối liên quan đột biến mất đoạn của mtDNA với bệnh ung thƣ - chỉ thị sinh học tiềm năng trong ung thƣ t bin m gen ca ty th t bit mn ln xy ra trong h gen ty th u r ra rt bin mt n nhiu bt m, hi chng Kearn  Sayre, hi ch8,9,16t bin mn trong h gen ty th phn lng s d t bin mn, s dng nhnh s bt bi dng t bin vi b t qu c li  t bin mn 50 bp xu khin D  Loop ca h gen ty th  8].  t bin mn 4977bp, 3938bp, 4388bp, 4576bp xut hic bit mn 4576t hit hin vi tn s 13%  n c 42].  t bin mn 3895 bp xy ra gi p li  u ti v   ng v c tip v  c ly   u hi 32]. S  s bng) mtDNA trong t   ng, vit bin m  th ng ch th sinh hc ti  n sm [23,24,41]. 1.3. UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG VÀ MỐI LIÊN HỆ VỚI ĐỘT BIẾN MẤT ĐOẠN 4977 BP XẢY RA TRONG DNA TY THỂ. 1.3.1. Ung thƣ đại trực tràng Khái niệm:     [2  [30].     2,29].    Nguyên nhân gây ung thư đại trực tràng: i trt ngun t mt polyp tuyn khng polyp ph bin   i tri kh  n nh vi m lon sn cao rn lu li cho rng nguy  mt s nh ng ca di khi u [21, 35]. Cnh   Yu t di truyn: Hot hoc ch khi u, sai hng trong sa ch  Yu t     d ng bii trong t              i, gi  chng tc hay nhim vinyl chlorid, anabolic steroid hoi lon trai ch phi tr21,35]. Phân loại các dạng ung thư đại trực tràng theo mô học: c ca T chc Y t th gii trc ng: u tuyi tit bi bin  carcinoid kt ht s dng him gp c t   y n [5 Hệ thống phân loại giai đoạn ung thư đại trực tràng Hit s h thc s dng r gii. S  th thua ti s dng trong vic cha tng b2, 9 lu cp n H thng TNM (TumorLymph NodeMetastases). H thn ung i trc, m lan rng ca khch bch huyt.  T cho bi, m t ca khi u. N cho bit cho khch bch huy ng hch bch huyt b m. M cho bit m c b ph. Các phương pháp chẩn đoán. m:  Chẩn đoán lâm sàng  du chng  Chẩn đoán hình ảnh: nng ng soi mm, t  Chẩn đoán mô học và tế bào học: k thut ch.  Chẩn đoán phân tửmt s CEAghi . 1.3.2. Mối liên hệ giữa đột biến mất đoạn 4977 bp xảy ra trong mtDNA và ung thƣ đại trực tràng Trong s n xy ra trong mtDNA, mn 4977 bp xy ra gi p li  u ti v 8482 13447c s quan n [31]. n mt t  v n 13446, g polypeptide ca phc h I (ND3, ND4, ND4L and ND5), 1 polypeptide ca phc h  polypeptide ca phc h               p t  22 tRNA cn thi tng hp protein trong ty th [51] t bin mn 4977 bp xy ra ph bin trong h gen ty th y trong nhiu lomc t cung, thc qun, d i trc i, ming, tha lot bin m s i u phn l 1.3.3. Các phƣơng pháp nghiên cứu biến đổi của gen trong ung thƣ PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism):     blot.  [24,34]. SSCP (Single strand conformation polymorphism): P  s AND. Ca DNA ph thu  bt c         i c          di chuyn vi t   [28, 29]. DHPLC (denaturing high performance liquid chromatography):   s  nhi cao, sau khi h nhi xut v s  d si gian di chuyt so vi s ng. [26, 27]. Realtime PCR: Trong sinh h t qu khui ADN c hin th ngay sau mi chu k nhit ca phn  ng tuyi s ng bn sao ca mt hay nhi c th ca mt mu ADN.  m huc hiu v ADN k n phm vi mc hin hunh quang. Qua ma phn ng sn phn s  l  da   ng sn phm [19]. Giải trình tự:         . -       th   (1) C    (2)   .  . S     (3)   Ch c n gene mun gi  bng hn phm khu gi trc tin pht plasmid gi na [58]. 1.3.4. Tình hình nghiên cứu đột biến mtDNA ở Việt Nam Ti Vii trng th  ng gp, sau   Cn thit trong vin, chu tr i tr n s u v i tr Vit Nam hin nay ch yu tng b n bn, rng ti vi th sinh hn b ng li liu kp th  sa b CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. NGUYÊN LIỆU 2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu Mẫu nghiên cứu: Ma bi try ti v i mu n u ly ti v i u khong 5-10 cm. Mẫu được cung cấp bởi: Khoa T  Gii phu bnh, bnh vin K Tam Hip   Gii phu bnh, bnh vin Vic  i. Số lượng: 65 cp mu 2.1.2. Hóa chất s d  cht  sch  2.1.3. Thiết bị t b c c m trm Cng ngh i hc Khoa hc T    . 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Tách chiết DNA tổng số từ mô Tiến hành: t DNA tng s s dt DNA t  n xut. 2.2.2. Khuếch đại đột biến mất đoạn 4977 bp mtDNA bằng PCR Thiết kế 4 cặp mồi: mtDNA, 49771, 4977ND3.     c hiu s dng phn mm thit k mi Primer Premier 5 v c tham kho t  d liu trong NCBI. Bảng 7. Bảng 7: Các cặp mồi đƣợc sử dụng trong phản ứng PCR Tên mồi Trình tự mồi Kích thƣớc sản phẩm (bp) mtDNA f  GAC GCC ATA AAA CTC TTC AC   433 r  GGT TGG TCT CTG CTA GTG TG   49771 f  TCA ATG CTC TGA AAT CTG TGG   496 r  GTT GAC CTG GGG TGA GAA G   49772 f  ACA GTT TCA TGC CCA TCG TC   381 r  GCG TTT GTG TAT GAT TTT GC   ND3 f  CCT GCC ACT AAT AGT TAT GTC   246 r  GAT ATG AGG TGT GAG CGA TA   Chu trình nhiệt của phản ứng PCR: Mồi mtDNA, 4977–1, ND3 Mồi 4977–2 2.2.3. Xử lý sản phẩm PCR khuếch đại đột biến mất đoạn 4977 bp mtDNA bằng enzyme HaeIII Enzym HaeIII n bi  :  kim a sn phm PCR ca cp mi 4977c 381bp. Sn phm PCR c x i enzyme gii hn HaeIIIng hp sn ph  cha 2 v n bit ca HaeIII. Khi ct s tc 141 bp, . Tin di kim tra sn phm cyacrylamide m b t qu. 2.2.4. Quy trình tinh sạch sản phẩm PCR sƣ ̉ du ̣ ng kit QIAQUICK gel extraction  tinh sc t n 10kb t gel agarose dng chun hoc dng low-m TBE hoc TAE. V c tit ct. c tin xut cung cp. 2.2.5. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel n di kim tra sn ph hay  c sn phm s dng loi gel    t hiu qu cao nht. Sn phc trn v n di. B c nhui tia t ngoi (UV). Hoc nhum b ng. 2.2.6. Phƣơng pháp giải trình tự.  kht bin hay bii ta phi gi trc tip.  tc ca hu h hiu di . Cu to ca m ng gi gm hai phn n di v         n di Ph n di  t bt ng mao qun cha gel. Phhin vng con mt c 2.2.7. Tính toán thống kê                  .            nh th2 vi m Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. ĐC ĐIỂM BỆNH HỌC LÂM SÀNG CỦA CÁC BỆNH NHÂN UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG TRONG NGHIÊN CỨU      i tr d                  Bảng 12. T kt qu trong Bảng 12 cho thng mi trp trung nhi hn  76,9n. Bảng 12: Thống kê mẫu tách chiết DNA cu ̉ a bê ̣ nh nhân ung thƣ đa ̣ i trƣ ̣ c tra ̀ ng theo các đặc điểm bệnh học lâm sa ̀ ng Đặc điểm Số lƣợng T lệ % Tui  15 23,1 >50 50 76,9 Gi Nam 31 47,7 N 34 52,3 V   31 47,7 Tr 32 49,2 i tr 2 3,1 Hch 0 15 23,1 13 19 29,2 >3 31 47,7    30 46,2  35 53,8 Lonh hc khi u n 65 100 3.2. KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ TỪ MẪU MÔ UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG S dt DNA QIAamp DNA Mini Kit cc). 65 cp mu  (mn u) ca 65 bi trt thu DNA tng s. Cu DNA tng s s c s dng  tin u tip theo. 3.3. KẾT QUẢ KHUẾCH ĐẠI ĐỘT BIẾN MẤT ĐOẠN 4977 bp CU ̉ A DNA TY THỂ BẰNG KỸ THUẬT PCR S dng DNA tng s t       . S d4 cp mi mtDNA, 4977-1, 4977-  . in di kim tra sn phm PCR. Kt qu  khui  bo th ca mtDNA (433bp)n gen n    (246bp)  n gen 381bp c  n sao mtDNA b m n 4977bp. Hình 11: Ảnh điện di sản phẩm PCR ở cả mẫu u và lân cận u 1: Sn phm PCR cp m 2: SP PCR cp m 3: Sn phm PCR cp mi 4977 4: SP PCR cp mi 4977 5:   100bp fermentas 6:   250bp Biolab 7: Sn phm PCR cp mi  8:Sp PCR cp m Hình 12: Ảnh kết quả điện di sản phẩm PCR có đối chứng âm 1: SP PCR cp m 2: SP PCR cp mn u 3: i chng () cp mi mtDNA 4: Sp PCR cp mi 4977 5: Sp PCR cp mi 49772 n u 6: i chng () cp mi 49772 7: Sp PCR cp m 8: Sp PCR cp m    n u 9: i chng () cp mi 10398 Mt b sn pht bin mn 4977- cho c sn phm ND3. Chng t  bt bin m bn sao t hit bin mn ng nht heteroplasmy  n sao mtDNA. t bin m xut hin  c mn u hay ch xut hin  t hin  lo ng ht biy ra  c n u. Hình 13: Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR trường hợp có đột biến mất đoạn 4977 bp trong mtDNA Ging 1: Sn phm PCR s dng cp mi 4977b 1 Ging 2: Sn phm PCR s dng cp mi 4977 ca b 1 Gii cha cp mi 4977-2 Ging 4:   100bp ca fermentas Ging 5: Sn phm PCR s dng cp mi 49772   ca b 2 Ging 6: Sn phm PCR s dng cp mi 4977 b 2 Ging 7: Sn phm PCR s dng cp mi 4977ca b 3 Ging 8: Sn phm PCR s dng cp mi 4977 ca b 3 t bin 4977- xy ra v biu hi xut hin  c 2 lon u) n hp b gi ch xut hin  ng hp b ging s c lng ht bin ch xut hin  ng hp b ging 7, 8. 3.4. KẾT QUẢ XỬ LÝ SẢN PHẨM PCR SỬ DỤNG CP MỒI 4977–2 BẰNG ENZYME GIỚI HẠN  kia sn phc 381 bp (cp mi 4977 ti n phm PCR vi enzyme gii hn HaeIIIng hp sn phm PCR  cha 2 v n bit ca HaeIII t s to t n phm c i enzyme cn di kii sn phi  (Hình 14). Hình 14: Ảnh kết quả xử lý sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi 4977–2 với enzyme giới hạn (điê ̣ n di trên gel agarose 1,3%, nhuô ̣ m ethidium bromide). Ging 1: Sn phm PCR cp mi 4977c khi ct bng HaeIII cn u. Ging 2: Sn ph   HaeIII n u. Ging 3 : Sn phm PCR s dng cp mi 4977c khi ct bng HaeIII  Ging 4: Sn ph   HaeIII  Ging 5: Thang ADN chun 100 bp T kt qu c trong Hình 14 n thy: sn phc khi ct bng HaeIII ch xut hic 381 bp, sn phm PCR sau khi ct bng HaeIII n di xut hic 141, 183 bp, 57 bp. Tin  n phm PCR (cp mi 4977t c t bin m t qu  y, sn phc nh k thut PCR mt ln na lc kh khui nh tin c tin p theo. 3.5. KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ SẢN PHẨM PCR CỦA ĐỘT BIẾN MẤT ĐOẠN 4977 bp CỦA mtDNA    n pht bin mn 4977-ch sn phm b   ch DNA ca QIAgen. Sn ph  c ki    polyacylamide 8%, nhum ethidium bromide. Sn ph tinh sch mong muc g trc tip. c kt qu gi dn mm Sequence scanner V1.0.  bng phn mm bioedit.  c t vic gi c so   d liu NCBI. Hình 15: Phần mềm đọc kết quả giải trình tự bioedit so sánh trình tự với cơ sở dữ liệu NCBI Sau khi ki  mtDNA ca NCBI, kt qu gi                 8470 13446. 3.6. PHÂN TÍCH MÔ ́ I LIÊN QUAN GIƢ ̃ A ĐÔ ̣ T BIÊ ́ N MÂ ́ T ĐOA ̣ N 4977 bp CU ̉ A DNA TY THÊ ̉ VA ̀ CA ́ C ĐĂ ̣ C ĐIÊ ̉ M BÊ ̣ NH HO ̣ C LÂM SA ̀ NG CU ̉ A BÊNH UNG THƢ ĐA ̣ I TRƢ ̣ C TRA ̀ NG. T t qu thc nghim th h git bin mn 4977 bp ca mtDNA  i tr 3.6.1. Khảo sát đột biến mất đoạn 4977 bp trong mtDNA của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng theo vị trí mô      gia t bin mn 4977   i tr, t bin mn 4977 bp trong mtDNA theo m n u. Kt qu Hình 16. [...]... ột biến là 98,46% Chúng ta nhân thấy rằng tỷ lệ đột biến mất đoạn 4977 bp của mtDNA bệnh nhân ung thư đại trực tràng ở việt nam là rất cao 3.6.2 Khảo sát đột biến mất đoạn 4977 bp trong mtDNA của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng theo các đặc điểm lâm sàng khác Tiến hành phân tìch mối liên quan giữa đột biến mất đoạn 4977 bp trong mtDNA của 65 bệnh nhân ung thư đại trực tràng với các đă ̣c điể m... trong số 104 bệnh nhân ung thư đại trực tràng nghiên cứu, có 20 (19.23%) bệnh nhân có mất đoạn 4977 bp ở mẫu mô u hoặc lân cận u Cụ thể là có 10 (9.62%) trong tổng số bệnh nhân có mất đoạn ở cả mô u và lân cận u, 7 bệnh nhân (6.73%) có mất đoạn ở mô u và 3 bệnh nhân (2.88 %) có mất đoạn ở mô lân cận u Tiến hành phân tìch một số đặc điểm lâm sàng và các yếu tố nguy cơ khác của ung thư đại trực tràng như... chúng tôi thu được cho thấy tỷ lệ đột biến mất đoạn 4977 bp là khá cao, trong số 65 bệnh nhân ung thư đại trực tràng được khảo sát, có 61 bệnh nhân (93,85%) có đột biến mất đoạn 4977 bp trong mtDNA được tím thấy trong mẫu mô u hoặc mô lân cận u Với một tỷ lệ đột biến rất cao và tỷ lệ đột biến ở mô lân cận u có phần cao hơn so với đột biến ở mô u của cùng một bệnh nhân Để giải thìch cho kết quả này,... trính tự 381 bp và 246 bp của cùng một mẫu mô trên bản gel điện di So sánh với kết quả nghiên cứu của Chen và cs về đột biến mất đoạn 4977 bp trong mtDNA của bệnh nhân ung thư đại trực tràng đã được công bố năm 2011 [33], nghiên cứu này được tiến hành trên 104 mẫu bệnh nhân ung thư đại trực tràng, sử dụng phương pháp realtime PCR để phân tìch mất đoạn 4977 bp mtDNA và định lượng mtDNA trên cả mẫu mô u... Bảng 14: Thống kê ty lệ đột biến mất đoạn 4977 bp trong mtDNA của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng theo các đặc điểm lâm sàng Đột biến mất đoạn 4977 bp Số Mô lân cận u Mô u Cả 2 mô Đặc điểm lƣợng Có Không Có Không Có Không ĐB(%) ĐB (%) ĐB(%) ĐB(%) ĐB(%) ĐB(%) Tuổi ≤50 >50 Nam Giới tình Nữ Đại tràng Vị trì Trực tràng ung thư Đại trực tràng 0 Hạch 13 >3 Ổ sùi Có loét Không T1N0-2M0-1 Phân T2N0-1M0 loại... trò của mất đoạn 4977 bp trong việc phát triển của ung thư đại trực tràng như sau: trong giai đoạn đầu, các tế bào ung thư do ảnh hưởng của các chất gây ung thư hoặc các tổn thư ng do oxi hóa sẽ xuất hiện các mất đoạn Các mtDNA bị mất đoạn có điều kiện thuận lợi trong quá trính sao chép tạo bản sao (do kìch thư c nhỏ hơn các mtDNA bính thư ng), Điều này dẫn đến sự tìch lũy các mtDNA mang mất đoạn 4977. .. phần trăm đột biến mất đoạn 4977 bp trong mtDNA của bệnh nhân ung thư đại trực tràng theo vị trí mô Như vậy, trong 65 mẫu nghiên cứu, tỷ lệ có đột biến m ất đoạn 4977 bp ở mô mô u và lân câ ̣n u tương ứng là 76,46% và 84,62% Tỷ lệ đột biến giữa mẫu mô u và mẫu mô lân cận u khác nhau không có ý nghĩa thống kê với mức ý nghĩa 0,05 Tình chung, có 65 mẫu có đột biến mất đoạn với ty lê ̣ đ ột biến là... có đột biến mất đoạn trong mô ung thư thấp hơn [33] Tuy nhiên, khi sử dụng phép kiểm định thống kê χ2 với mức ý nghĩa α = 0.05 để đánh giá mối liên hệ giữa tỷ lệ đột biến mất đoạn 4977 bp mtDNA của bệnh nhân ung thư đại trực tràng với các đặc điểm lâm sàng thí cho thấy tỷ lệ đột biến mất đoạn 4977 bp mtDNA không phụ thuộc vào các đặc điểm lâm sàng bao gồm nhóm tuổi, giới tình, vị trì ung thư, số lượng... giai đoạn ung thư, chỉ số khối cơ thể (BMI – Body Mass Index), nhóm nghiên cứu nhận thấy không có mối tương quan được tím thấy giữa tỷ lệ đột biến mất đoạn 4977 bp mtDNA trong các mô u và lận cận u với độ tuổi, tính trạng di căn, chỉ số BMI Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phân tich m ối liên hệ giữa tỷ lệ đột biến mất đoạn 4977 ́ bp mtDNA với các đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân ung thư đại trực tràng. .. biệt về tỷ lệ đột biến mất đoạn 4977 bp trong mtDNA giữa nhóm tuổi, giới tình, vị trì ung thư, số hạch, ổ sùi loét và phân loại TNM giữa mẫu mô u và mẫu mô lân cận u và tỷ lệ đột biến mất đoạn là rất cao (>70%) Nhưng không có ý nghĩa thống kê (p>0,05) 3.7 THỐNG KÊ MỨC ĐỘ HETEROPLASMY XẢY RA TRONG MT DNA Thống kê mức độ heteroplasmy xảy ra trong mtDNA của 65 bệnh nhân ung thư đại trực tràng được trính . lệ đột biến mất đoạn 4977 bp trong mtDNA của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng theo các đặc điểm lâm sàng Đặc điểm Số lƣợng Đột biến mất đoạn 4977 bp. [23,24,41]. 1.3. UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG VÀ MỐI LIÊN HỆ VỚI ĐỘT BIẾN MẤT ĐOẠN 4977 BP XẢY RA TRONG DNA TY THỂ. 1.3.1. Ung thƣ đại trực tràng Khái niệm: