Nghiên cứu phương pháp phân lập Zerumbone có chất lượng cao từ thân rễ gừng gió (zingiber zerumbert sm.) chuyển hóa Zerumbone thành hợp chất có hoạt tính sinh học Lê Thị Thùy Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Khoa Hóa học Luận văn ThS Chuyên ngành : Hóa hữu cơ; Mã số: 60 44 27 Người hướng dẫn: PGS.TS Văn Ngọc Hướng Năm bảo vệ: 2011 Abstract: Khái quát chi Gừng (Zingiber), Gừng gió (Zingiber zerumbet Sm), cơng dụng hoạt chất sinh học Gừng gió (Zingiber zerumbet Sm) Trình bày phương pháp thực nghiệm: phương pháp phân lập zerumbone từ thân rễ gừng gió; điều chế dẫn xuất Zerumbone; khảo sát hoạt tính chống ung thư dẫn xuất Zerumbone Đưa kết nghiên cứu thảo luận: điều chế Zerumbone chất lượng cao (> 99%);tTổng hợp số dẫn xuất zerumbone khảo sát hoạt tính chống ung thư chúng; khảo sát hoạt tính chống ung thư 3-isopropylaminozerumbone Keywords: Hóa hữu cơ; Hoạt tính sinh học; Hóa học; Cây gừng Content Gừng gió (Zingiber zerumbet Sm) thuốc dân tộc tiếng từ lâu đời không nước ta mà cịn nhiều nước Đơng Nam Á Indonexia, Thái Lan, Miến Điện… Gừng gió mọc hoang dại phổ biến nước ta từ Bắc tới Nam, đặc biệt tỉnh miền núi nước ta Hợp chất có hoạt tính sinh học gừng gió Zerumbone- chất có hoạt tính phịng ngừa chống ung thư mạnh 10 loại ung thư khác nhau, đặc biệt ung thư gan ung thư vú Vì vậy, gần 20 năm trở lại đây, Zerumbone nhận quan tâm nhiều nhà khoa học giới, đặc biệt nhà khoa học Nhật Bản Mỹ Ngoài nghiên cứu gần nhà khoa học chứng minh dẫn xuất zerumbone có hoạt tính phịng ngừa chống ung thư mạnh Chính mà chúng tơi đặc biệt quan tâm tới việc điều chế zerumbone có chất lượng cao từ gừng gió để chuyển hóa zerumbone thành chất khác nhằm tạo hợp chất có hoạt tính sinh học phục vụ cho ngành y dược Đấy lí mà chọn đề tài:“ Nghiên cứu phương pháp phân lập zerumbone có chất lượng cao từ thân rễ gừng gió( Zingiber zerumbet Sm) chuyển hóa zerumbone thành hợp chất có hoạt tính sinh học.” Gừng gió (Zingiber zerumbet Sm) thuốc dân tộc, mọc hoang phổ biến nước ta Như tổng quan trình bày, 20 năm trở lại kết nghiên cứu nước hoạt tính chống ung thư Zerumbone khẳng định rằng: Zerumbone tác nhân chống ung thư mạnh, ức chế phát triển 10 loại ung thư khác Cơ chế chống ung thư Zerumbone chứng minh rõ ràng, thúc đẩy trình tự chết (apoptosis) tế bào ung thư làm cho ung thư khơng phát triển được, ức chế NF- kB hoạt động nên ngăn ngừa tạo thành ung thư phát triển ung thư Zerumbone lại không độc, nguyên liệu cho điều chế zerumbone gừng gió (Zingiber zerumbet Sm)- nước ta lại có nhiều chất lượng tốt, gần người ta phát số dẫn xuất zerumbone có hoạt tính chống ung thư túi mật mạnh zerumbone nhiều Chính mà điều chế Zerumbone có chất lượng cao để tổng hợp dẫn xuất zerumbone có hoạt tính sinh học mục tiêu nội dung đề tài Điều chế zerumbone có chất lượng cao Đề tài phần đề tài nghiên cứu khoa học quốc gia mã số CNHD- ĐT- 018/10-11 thuộc chương trình KHCN trọng điểm quốc gia phát triển CN hóa dược đến năm 2020 Trong đề tài người ta xác định nguyên liệu cho sản xuất zerumbone củ gừng gió (rhizomer of Zingiber zerumbet Sm) thu mua Tam Đảo tỉnh Vĩnh Phúc vào cuối tháng 11 dương lịch, ThS Nguyễn Quốc Bình thu mua, phân loại, giám định cung cấp Điều chế zerumbone từ củ gừng gió tươi hay củ gừng gió khơ Khảo sát sinh lý củ gừng gió chúng tơi cho thấy từ lúc thu hoạch cuối tháng 11 đầu tháng 12 dương lịch, bảo quản đến tháng tháng năm sau củ gừng gió mọc mầm biến chất, hàm lượng Zerumbone thấp Chính lí nên nghiên cứu điều chế zerumbone từ bột củ gừng gió khơ, hiệu suất chuyển đổi từ củ khô 14,28%, nguyên liệu khô cho phép sản xuất quanh năm nên thuận tiện cho việc cơng nghiệp hóa q trình sản xuất Để thu phần không phân cực chúng tơi chiết tổng chất bột củ gừng gió khơ EtOH 96%, loại bớt EtOH cịn 1/5 thể tích, pha thêm 4/5 nước muối 10% chiết n-hexan, sau làm khơ loại n-hexan phần khơng phân cực hiệu suất đạt 4% tính theo nguyên liệu khô Từ phần không phân cực tiến hành điều chế zerumbone tinh khiết phương pháp: Sắc ký cột (CC), sắc ký lớp mỏng điều chế (PTLC) phương pháp kết tinh phân đoạn (FCr) So sánh chất lượng hiệu suất zerumbone phương pháp số liệu bảng 3.1 Bảng 3.1: Hiệu suất zerumbone thu từ phương pháp phân lập khác Phương pháp CC PTLC FCr Hiệu suất (%) 0,10 0,08 0,35 Điểm chảy 66-67% 66-67% 66-67% Rf 0,75 0,75 0,75 Kết cho thấy phương pháp tối ưu để điều chế Zer tinh khiết từ thân rễ gừng gió kết tinh phân đoạn nhiệt độ thấp Từ kết đề xuất quy trình cơng nghệ sản xuất zerumbone tinh khiết sơ đồ 3.1 Thực trình cách nghiêm chỉnh thu zerumbone 99,5% đạt hiệu suất 0,35% tính theo nguyên liệu tươi Trong cách chiết phần khơng phân cực qua phương pháp sắc ký cột Abdul cộng phát minh số US2009/0239953 A1 công bố Sep.24,2009 thu zerumbone với hiệu suất 0,062% tính theo nguyên liệu tươi Trong tài liệu khác chúng tơi chưa tìm thấy quy trình điều chế zerumbone từ củ gừng gió có hiệu suất cao Sự trình bày cho thấy quy trình điều chế zerumbone 99,5% từ củ gừng gió vùng Tam Đảo có nhiều ưu điểm cho hiệu suất cao, nhiên hiệu suất sản phẩm phụ thuộc chất lượng nguyên liệu Bột củ gừng gió khơ Chiết EtOH 96% Loại bớt EtOH 1/5V Thêm 4/5V nước muối, chiết n-hexan Làm khô, loại n-hexan Công đoạn I Điều chế dầu Zerumbone Dầu Zerumbone Kết tinh chậm nhiệt độ thấp Lọc qua phễu thủy tinh xốp G4 Công đoạn II Điều chế Zerumbone thô Zerumbone thô Kết tinh phân đoạn nhiệt độ thấp dung mơi thích hợp Lọc butne qua giấy lọc Công đoạn III Điều chế Zerumbone tinh khiết Zerumbone tinh khiết Sơ đồ 3.1 : Quy trình cơng nghệ sản xuất Zerumbon tinh khiết từ bột củ gừng gió khơ Độ tinh khiết sản phẩm kiểm tra UPLC- MS máy sắc phổ cho pic (phụ lục trang 62) Cấu trúc Zerumbone chứng minh phương pháp phổ : + Phổ khối Zerumbone cho pic M+H =219,19 nghĩa phân tử lượng Zer-1 218 đv (xem phụ lục 2) + Phổ IR cho thấy phân tử Zerumbone có liên kết đơi nhóm dạng trans có H = 965,18cm-1 liên kết đơi ba nhóm có H = 831,33cm-1 (xem phụ lục trang 63) + Phổ 1H-NMR cho thấy phân tử Zer-1 có 2H liên kết đôi loại E dạng pic AB, dd 5,96ppm 5,88ppm, J = 16,40Hz Hai nhóm metyl có H = 6,00; J = 11,12Hz H = 5,25 J = 10,63, nhóm metylen có H = 1,90; J = 12,72 Một nhóm gemdimetyl có H = 1,07 1,20ppm dạng singlet metyl singlet khác có H = 1,79 1,54ppm (xem phụ lục 4) + Phổ 13C-NMR cho thấy phân tử Zerumbone có 15 nguyên tử cacbon, có nhóm >C=O, C = 204,33 ppm cacbon olefin có độ chuyển dịch hóa học từ 124ppm đến 160ppm cacbon vùng trường mạnh có C từ 11ppm đến 42ppm (phụ lục 5) + Phổ DEPT cho thấy phân tử Zerumbone có nhóm CH3, nhóm CH2, nhóm CH (phụ lục 6) Dựa liệu phổ, công thức phân tử Zerumbone xác định C15H22O , cơng thức cấu tạo hình 3.1 liệu phổ thể bảng 3.2 Hình 3.1: Cơng thức cấu tạo Zerumbone Bảng 3.2: Số liệu phổ NMR Zerumbone 13 C-NMR H-NMR Số C C ppm H ppm Số H Độ bội J.Hz 42.38 2.45; 1.90 2H d,d 11.39; 12.72 127.14 2.50 1H t 10.60 136.26 6.01 39.42 2.34 2H t 12.55 29.61 2.22 2H q 12.00 148.80 6.01 1H t 11.32 137.93 204.33 124.97 5.97 1H d 16.37 10 160.72 5.87 1H d 16.40 11 37.84 12 15.19 1.54 3H s 13 11.76 1.79 3H s 14 24.38 1.07 3H s 15 24.17 1.20 3H s Tổng hợp số dẫn xuất zerumbone khảo sát hoạt tính chống ung thư chúng Zerumbone serquyterpen xeton vịng lớn, ,  khơng no, có cơng thức chung C15H22O, cấu tạo phân tử hình 3.1, tên gọi hóa học 2,6,9,9tetramethyl- (E,E,E)- 2,6,10- cycloundecatrien-1- on Hợp chất cacbonyl ,  không no tự nhiên loại hợp chất có hoạt tính sinh học lý thú nhà khoa học giới đặc biệt quan tâm Zerumbone ví dụ điển hình trình bày phần tổng quan, hoạt tính sinh học bật zerumbone ức chế mạnh phát triển tế bào ung thư theo chế apoptosis, loại trừ NF- kB hoạt động Nhóm chức sinh học zerumbone nhóm cacbonyl ,  không no Vào năm 2010 Uraiwan Songsiang cộng dẫn xuất 3amino, 3- amino có hoạt tính chống phát triển dòng ung thư túi mật khác nồng độ IC50  75 M nồng độ zerumbone khơng có tác dụng- kết thú vị [42] Theo hướng người ta tổng hợp nhiều dẫn xuất zerumbone nhằm nâng cao hiệu zerumbone Cấu tạo phân tử Zerumbone cho thấy có nhiều khả tổng hợp dẫn xuất Zerumbone như: dẫn xuất nhóm cacbonyl, dẫn xuất liên kết đơi liên hợp với nhóm C=O, dẫn xuất liên kết đôi độc lập (C6=C7) dẫn xuất oix hố mở vịng Đứng đầu chuyển hoá Zerumbone nhà khoa học Nhật Bản [25] Theo hướng chuyển hóa Zerumbone thành hợp chất có hoạt tính sinh học chúng tơi amin hóa zerumbone amoniac isopropylamin Khảo sát hoạt tính chống ung thư 3-isopropylamino-Zerumbone Nhằm làm rõ hiệu hoạt tính chống ung thư: ung thư gan HepG2; ung thư phổi- Lu ung thư tim RD dẫn xuất 3-isopropylaminozerumbone so với zerumbone khảo sát hoạt tính chống ung thư hợp chất dòng ung thư kể trên.Kết thể bảng sau: Bảng 1: Khả gây độc tế bào 3-isopropylamino-Zer Zer Ký hiệu mẫu IC50 (g/mL) HepG2 Lu RD Zerumbone 0,31 1,00 0,36 3-isopropylamino-Zerumbone 2,23 >5 >5 Kết cho thấy hoạt tính chống ung thư dẫn xuất 3-isopropylaminozerumbone yếu nhiều so với Zerumbone dòng ung thư thử Điều cho thấy hệ thống liên kết đơi liên hợp với nhóm cacbonyl phân tử zerumbone bị giảm hoạt tính chống ung thư zerumbone dòng ung thư HepG2,Lu RD bị giảm References TIẾNG VIỆT Báo cáo tổng kết đề tài QGTD0309-2006 tháng 2 Báo cáo kỉ niệm 45 năm thành lập Viện Dược liệu TW 9-5-200 Lê Trần Đức (1997), Cây thuốc việt nam Trồng hái chế biến trị bệnh ban đầu, tr 291-292, NXB nông nghiệp, Hà nội Võ văn Chi (1997), Từ điển thuốc Việt nam, tr 536, NXB Y học Võ Văn Chi, Dương Đức Tiến (1987), Phân loại thực vật Thực vật bậc cao, tr 461-464, NXB Đại học Trung học chuyên nghiệp, Hà nội Trịnh Đình Chính (1995), Nghiên cứu thành phần hóa học tinh dầu số thuộc họ Gừng (Zingiberaceae) Việt nam, Luận án PTS Khoa học Hóa học, Trường ĐH Sư phạm Hà nội I Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt nam, 3, tr 553, NXB Trẻ Hà Nội Đỗ Tất Lợi (2005), Những thuốc vị thuốc Việt nam, in lần thứ mười ba, tr 368- 369, NXB Y học Hà Nội Lã Đình Mỡi, Lưu Đàm Củ, Trần Minh Hợi, Trần Huy Thái, Ninh Khắc Bản (2002), Tài nguyên thực vật có tinh dầu Việt nam, tập 2, tr 94-119, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội 10 Nguyễn Quang Thạch (2009), Cơ sở công nghệ sinh học tập 3, Công nghệ sinh học tế bào, trang 343-344, Nhà xuất giáo dục Việt Nam 11 Văn Ngọc Hướng, Đỗ Thị Thanh Thúy (2006), Gừng gió (Zingiber zerumbet Sm) vùng Tam Đảo, nguyên liệu quý cho điều chế Zerumbone, Tạp chí Khoa học công nghệ, tập 44, số 3, trang 65-69 TIẾNG ANH 12 A Hoffman, L M Spetner and M Burke (2002), “Redox-regulated mechanism may account for zerumbone’s ability to suppress cancer-cell proliferation”, Carcinogenesis 23 (11): 1961-1962 13 Abdul, A.B.H., A.S Al-Zubairi, N.D Tailan, S.I.A Wahab, Z.N.M Zain, S Ruslay and M.M Syam (2008), “Anticancer activity of natural compound (zerumbone) extracted from Zingiber zerumbet in human HeLa cervical cancer cells”, International Journal of Pharmacology 4, (3), 160 168 14 Ahmad Bustanmam Abdul (2009), US2009/0239953 15 Bokyung Sung, Sonia Jhurani, Kwang Seok Ahn, Yoichi Mastuo, Tingfang Yi, Sushovan Guha, Mingyao Liu, and Bharat B Aggarwal (2008), “Zerumbone Down-regulates Chemokine Receptor CXCR4 Expression Leading to Inhibition of CXCL12-Induced Invasion of Breast and Pancreatic Tumor Cells”, Cancer Res, 8938-8944 16 Buckingham J (1982), “Dictionary of Organic compounds”, New YorkLondon-Toronto, Chapman and Hall, 5, 5763 17 Dai.J.R., Cadellina II.J.H., Mc Mahon.J.B., and Boyd.M.R (1997), “Zerumbone, an HIV-inhibitory and cytotoxic sesquiterpene of Zingiber aromaticum and Z zerumbet”, Natl Prod Lett, 10, 115-118 18 Dae Sik Jang, Ah-Reum Han, Gowooni Park, Gil-Ja Jhon, Eun-Kyoung Seo (2004), “Flavonoids and aromatic compounds from the Rhizomes of Zingiber zerumbet”, Arch Pharm Res 27, (4), 386-389 19 Dai J.R et al (1997), Nat Prod Lett 10, 115-118 20 Dev S (1960), Tetrahedron 8, 171-180 21 Dung.N.X., chinh.T.D., Piet A.Leclereq (1995), “Chemical investigation of the acrial part of Zingiber zerumbet (L.) Sm from Vietnam”, Jour Essent Oil Res.(USA), (2), 153-157 22 Huang.G.C., Chien.T.Y., Chen.L.G., Wang.C.C (2005), “Antitumor effects of zerumbone from gingiber zerumbet in P-388D1 cells in vitro and in vivo”, Planta Med, 71 (3), 219-224 23 Kirana C, McIntosh GH, Record IR, Jones GP (2003), “Antitumor activity of extract of Zingiber aromaticum and its bioactive sesquiterpenoid zerumbone”, Nutr Cancer.45(2):218-25 24 Matthes.H.W.D., Luu.B., Ourisson.G (1980), “Cytotoxic components of Zingiber zerumbet, curcuma zedoaria and C domestica”, Phytochemistry, 19, 2643-2650 25 Masuda.T., Jitoe.A., Kato.S., Nakatani.N (1991), “Acetylated flavonol glycosides from Zingiber zerumbet”, Phytochemistry, 30, 2391-1392 26 M Golam KADER, M Rowshanul HABIB, Farjana NIKKON, Tanzima YEASMIN, Mohammad A RASHID, M Mukhlesur RAHMAN, Simon GIBBONS (2010), “Zederone from rhizomes of Zingiber zerumbet and staphylococus activity”, Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas, (1), 63 – 68 27 Mohamed Yousif Ibrahim , Ahmad Bustamam Hj Abdul, Tengku Azmi Tengku Ibrahim, Siddig Ibrahim AbdelWahab, Manal Mohamed Elhassan and Syam Mohan (2010), “Attenuation of cis platin- induced nephrotoxity in rats using Zerumbone”, African Journal of biotechnology Vol 9, 44344444 28 Murakami.A, Takahashi.M., Jiwajinda.S., Koshimizu.K., Ohigashi (1999), “Identification of zerumbon in Zingiber zerumbet Smith as Potent inhibitor of 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate induced Epstein-Barr virus activation”, Biosci Biotechnol Biochem, 63 (10), 1811-2 29 Murakami.A., Takahashi.D., Kinoshita.T., Koshimizu.K., Kim H.W., Yoshihiro.A., Kakamura.Y., Jiwajindo.S., Terao.J., Ohigashi.H (2002), 10 “Zerumbone, a southeast Asian ginger sesquiterpene, markedly suppresses free radical generation, proinflammatory protein production, and cancer cell proliferation accompanied by apoptosis the alpha, beta-unsatureted carbonyl group is a prerequisite”, Carcinogenesis, 35 (5), 795-802 30 Nakamura.Y., Yoshida.C., Murakami.A., Ohigashi.H., Osawa.T., Uchida.K (2004), “Zerumbone, a tropical ginger sesquiterpene, activates phase II drug metabolizing enzymes”, FEBS Letters, 13, 572 (1-3), 245-250 31 N.P Damodaram and Sukh Dew (1965), “Stereochemistry of Zerumbone”, Tetrahedron Letters, 24, 1977-1981 32 Ozaki.Y., Kawahara.N., and Harada.M (1991), “Anti-inflammatory effect of Zingiber cassumunar.Roxb and its active principles”, Chem.Pharm Bull, 39, 2353-2356 33 Samir Kumar Sadhu, Amina Khatun, Takashi Ohtsuki, Masami Ishibashi (2007), “First isolation of sesquiterpenes and flavonoids from Zingiber spectabile and identification of Zerumbone as the major cell groth inhibitory component”, Natural product research, 21, (14), 1242-1247 34 Sal S.R et al (1981), Aust J Chem 34, 243-247 35 SA Sharifah Sakinah, S Tri Handayani and LP Azimahtol Hawariah (2007), “Zerumbone induced apoptosis in liver cancer cells via modulation of Bax/Bcl-2 ratio”, Cancer Cell International 7, 1186 36 Takahashi.S et al (2002), Japanese Journal of cancer and chemotherapy, 27, 70 37 Takashi Kitayama et al (2001), “ Chemistry of Zerumbone, part Regulation of Ring bond Cleavage and unique antibacterial activities of Zerumbone derivatives”, Biosci, Biotechnol Biochem 65, 2193-2199 38 Takashi Kitayama et al (2003), “ The chemistry of Zerumbone part Structural transformation of the dimethylamine derivatives”, Tetrahedron 59, 4857-4866 39 Takashi Kitayama et al (2002), “ The chemistry of Zerumbone IV Asymetric Synthesis of Zerumbol”, Journal of Molecular Catalysis 17, 75-79 11 40 Takashi Kitayama et al (2007), “ Synthesis of a novel inhibitor against MRSA and VRE: preparation from Zerumbone ring opening material showing histidine-kinase inhibition”, Bioorganic and Medicinal chemistry Letter 17, 1098-1101 41 Takada Y, Murakami A, Aggarwal BB (2005), “ Zerumbone abolishes NFkappaB and IkappaBalpha kinase activation leading to suppression of antiapoptotic and metastatic gene expression, upregulation of apoptosis, and downregulation of invasion” 42 Uraiwan Songsiang et al (2010), “ Cytotoxicities against cholagiocarcinoma cell lines of Zerumbone derivatives”, European Journal of Medicinal Chemistry 45, 3794-3802 43 Vimala.S., Norhanom.A.W., Yada.M (1999), “ Anti-tumour promoter activity in Malaysian ginger rhizobia used in traditional medicine”, British Journal of cancer, 80, 110-116 12 ... phương pháp phân lập zerumbone có chất lượng cao từ thân rễ gừng gió( Zingiber zerumbet Sm) chuyển hóa zerumbone thành hợp chất có hoạt tính sinh học. ” Gừng gió (Zingiber zerumbet Sm) thuốc dân... chế zerumbone có chất lượng cao từ gừng gió để chuyển hóa zerumbone thành chất khác nhằm tạo hợp chất có hoạt tính sinh học phục vụ cho ngành y dược Đấy lí mà chọn đề tài:“ Nghiên cứu phương pháp. .. chế Zerumbone có chất lượng cao để tổng hợp dẫn xuất zerumbone có hoạt tính sinh học mục tiêu nội dung đề tài Điều chế zerumbone có chất lượng cao Đề tài phần đề tài nghiên cứu khoa học quốc gia