PHẦN III MỘT SỐ ỨNG DỤNG CHỦ YẾU CỦA CÔNG NGHỆ GEN CHƯƠNG VIII ỨNG DỤNG KỸ CÔNG NGHỆ GEN TRONG Y HỌC VÀ CHẨN ĐOÁN I. Kỹ thuật gen trong sản xuất chế phẩm sinh học 1. Sản xuất insulin tái tổ hợp 1.1 Lược sử nghiên cứu insulin - Do các tế bào beta của tuyến tụy sản xuất, đóng vai trò chuyển hóa đường - Bệnh tiểu đường (Diabetes) do thiếu hụt insulin. - Từ năm 1922 đã tách chiết insulin từ tụy bò và lợn để điều trị tiểu đường - Cấu trúc phân tử insulin người được phát hiện vào năm 1926. Năm 1955 Sanger và cộng sự đã giải trình tự và sắp xếp acid amin - 1963-1965 đã tổng hợp nhân tạo bằng con đường hóa học ⇒ đắt, không phù hợp - 1967, phát hiện cấu trúc proinsulin - 1969, phát hiện 3 dạng cấu trúc - 1978, sản xuất insulin tái tổ hợp trong E.coli - 1982, insulin được phép lưu hành ở châu Ậu. Bán ở Mỹ năm 1983 1.2 Cấu trúc gen mã hóa insulin ở người • Gen mã hóa insulin (IND) nằm trên NST số 11, trên cánh ngắn (11p) • Vùng không mã hóa chia làm 3 cụm gen ký hiệu I, II và III • Vùng mã hóa có kích thước 1430 bp. Trong vùng mã có 2 intron. • Đoạn gen mã hóa cho 4 peptid của phân tử insulin: Chuỗi peptid tín hiệu (leader), chuỗi B, chuỗi C và chuỗi A Preproinsulin is difficult for E.coli to produce Contains a signal sequence + A,B, C sections of protein Signal sequence is removed after targeting to RER Translation continues on RER (forming proinsulin) Removal of 33 amino acids at Golgi and S-S joining of A and B chains to form insulin Insulin Insulin is made up of 2 chains = 51 amino acids total A chain = 21 amino acids B chain = 30 amino acids In reality both chains are present in the same protein 1.3 Công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp Nguyên lý chung bao gồm: - Tách chiết và tính sạch RNA thông tin mã hoá preproinsulin - Thực hiện kỹ thuật phiên mã ngược - Sử dụng enzym giới hạn loại bỏ gen mã hóa chuỗi C, tách dòng riêng từng đoạn gen mã hóa chuỗi A và B - Tạo vector biểu hiện gen đoạn A và B - Biến nạp riêng mỗi loại vector trong E.coli - Thực hiện quá trình lên men thu protein chuỗi A- lacZ và B-lacZ - Thu riêng từng loại protein lai và thực hiện phản ứng cắt với cyanur bromid giữa a.a cuối cùng của insulin và a.a của β-galactosidase - Tách và tinh sạch chuỗi A và B, sau đó tạo hỗn hợp chuỗi A và B, hình thành cầu nối disulfit và thu insulin thành phẩm [...]... các bước - Tách chiết và tinh sạch mRNA từ tế bào thùy trước tuyến yên và thực hiện kỹ thuật phiên mã ngược - Sử dụng enzym giới hạn cắt bỏ đoạn gen mã hóa 2 3-2 4 a.a của chuỗi peptid tín hiệu - Chuyển gen mã hóa hGH vào vector biểu hiện thích hợp - Biến nạp vector TTH vào E.coli, nuôi cấy, thu sinh khối, tách chiết và tinh sạch hGH - Tế bào biểu hiện: vi khuẩn, baculovirus, nấm men, tế bào trứng chuột... Inhibitory proteins 3.2 Gen mã hóa ở người và cơ chế sinh IFN • Trong tế bào người IFN-α mã hóa bởi 22 gen nằm trên cánh ngắn của NST số 9, gen mã hoá IFN-β nằm trên NST số 2 • Gen mã hóa IFN-γ nằm trên NST số 12, gồm 4 exon Sản xuất trong tế bào lympho T Vai trò của IFN trong trị bệnh do nhiễm virus • Điều trị viêm gan và ứng dụng trong điều trị ung thư Tuberculosis susceptibility genes Y VDR IFNγR1 Y... •Alpha-2a drug name Roferon •Alpha-2b drug name Intron A •Alpha-n1 drug name Wellferon •Alpha-n3 drug name AlferonN •Alpha-con1 drug name Infergen •Recombinant forms of beta interferon include: •Beta-1a drug name Avonex •Beta-1b drug name Betaseron •Recombinant forms of gamma interferon include: •Gamma-1b drug name Acimmune How Does It Prevent Viral Replication? virus cells (Other stimuli: exogenous... trúc gen mã hóa hormon sinh trưởng người • Họ gen có 5 gen mã hóa, nằm trên cánh dài NST thứ 17, kích thước 66 kb • Gen mã hóa hGH bị đột biến hoặc rối loạn, dẫn đến thiếu hụt hormon sinh trưởng, gây hội chứng lùn bẩm sinh • Gen hGH có đoạn trình tự mã hóa chuổi peptid tín hiệu không tương thích promoter của E.coli, do đó biểu hiện gen hGH tái tổ hợp trong E.coli rất yếu hoặc không hoạt động 2.3 Công nghệ. .. xác định - 1985, hãng Genetech sản xuất thành công hGH có tên Protropin • Hormon sinh trưởng người hiện nay chủ yếu sản xuất bằng phương pháp tái tổ hợp gen Có nhiều sản phẩm thương mại giúp điều trị bệnh hay giúp cho phát triển cơ bắp • hGH là protein nhỏ, có 191 a.a Trong phân tử có 2 liên kết disulfit • Các gen mã hóa hGH của người, bò… chuyển vào động vật như cá, lợn,…tạo động vật chuyển gen phát... insulin gene Route to the Production by Bacteria of Human Insulin Overview of gene cloning Cloning animati on 2 Sản xuất hormon sinh trưởng tái tổ hợp 2.1 Lịch sử nghiên cứu hormon sinh trưởng - Hormon sinh trưởng người (hGH – Human Growth Hormone) phát hiện năm 1920 Năm 1950 đã tách chiết hGH từ tuyến yên người - 1956, hGH tách từ não bò, cừu, … dùng để chữa bệnh lùn ở trẻ em - 1972, cấu trúc phân tử của. .. Giá thành đắt - Tháng 1 năm 1980 thành công sản xuất IFN bằng con đường TTH trong E.coli - Interferon là protein hoặc glycoprotein, TLPT – 1 6-4 5 kDa Có tác dụng ngăn cản sự xâm nhiễm của virus hoặc kìm hãm phát triển khối u - Interferon chia làm 2 nhóm: ♣Nhóm 1: IFN α, IFN β, IFN ω ♣Nhóm 2: IFN γ kém bền trong acid General Action of Interferons • Interferons are small proteins released by macrophages,... IFN trong trị bệnh do nhiễm virus • Điều trị viêm gan và ứng dụng trong điều trị ung thư Tuberculosis susceptibility genes Y VDR IFNγR1 Y P2X7 IFNγ NRAMP1 iNOS STAT1 IFNγR2 IL-12Rβ2 Y IL-12Rβ1 Y Y MBL HLA-DR2 IL-1β TNF IL-10 IL-12 T cell/NK cell Infected Macrophage Shown to be linked or associated with TB in more than one population Conflicting studies –both +ve and –ve associations with TB reported... interferon - Năm 1930, phát hiện gia súc nhiễm bệnh do một loại virus này, ít bị nhiễm loại virus khác Isaacs và Linderman (1957) khi nuôi cấy phôi gà đã phát hiện 1 loại protein mới gây ức chế tái bản virus, gọi là interferon (IFN) - Trước năm 1980, sản xuất IFN từ tế bào bạch cầu người, lây nhiễm virus, sau đó nuôi trong phôi gà để tế bào bạch cầu sinh IFN ⇒ Giá thành đắt - Tháng 1 năm 1980 thành công. .. insulin gene is the hard part Route to the Production by Bacteria of Human Insulin One cell with the recombinant plasmid This is the step when gene cloning takes place A fermentor used to grow recombinant bacteria The single recombinant plasmid replicates within a cell Then the single cell with many recombinant plasmids produces trillions of like cells with recombinant plasmid – and the human insulin gene