BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP.HCM KHOA MÔI TRƯỜNG & CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÀI GIẢNG THỰC HÀNH VI SINH ỨNG DỤNG Biên soạn: TS. Nguyễn Hoài Hương 1 - 2009 - 2 Giới thiệu môn học Môn thực hành vi sinh ứng dụng nhằm giúp sinh viên làm quen với các phương pháp phân lập, khảo sát các vi sinh vật được ứng dụng trong xử lý môi trường, công nghệ lên men . Các vi sinh ứng dụng thường được phân lập từ môi trường tự nhiên, chúng có khả năng sử dụng các cơ chất khác nhau, chuyển hóa vật chất trong tự nhiên. Nguồn phân lập chúng có thể từ đất, nước, động vật, thực vật hay thực phẩm. Phân lập, xác định chức năng, định danh chúng là bước đầu đưa chúng vào ứng dụng. Trong khuôn khổ bài thực hành môn vi sinh ứng dụng sinh viên phân lập vi sinh vật chủ yếu từ môi trường đất. Đất là một trong những cơ chất thuận lợi nhất đối với sự phát triển của các loại vi sinh vật khác nhau. Số lượng vi sinh trong 1 g đất có tới hàng trăm triệu, thậm chí hàng tỉ tế bào. Hoạt động sống của vi sinh vật đất có liên quan đến nhiều quá trình xảy ra trong đất, trước hết là các vòng tuần hoàn của vật chất trong tự nhiên như chu trình carbon, chu trình nitơ, phospho và lưu huỳnh. Các bước chung của bài thực hành là 1. Phát hiện các nhóm vi sinh vật trong mẫu đất bao gồm đại diện của một số nhóm phân loại 2. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh trưởng và hình thái tế bào học tế bào của các đại diện thuộc vi sinh vật phân lập được. NỘI DUNG THỰC HÀNH BÀI 1: VI KHUẨN AMÔN HÓA BÀI 2: VI KHUẨN NITRAT HÓA BÀI 3: VI KHUẨN PHẢN NITRAT HÓA BÀI 4: VI KHUẨN CỐ ĐỊNH NITƠ BÀI 5: VI SINH VẬT PHÂN GIẢI CELLULOSE 3 BÀI 1: VI KHUẨN AMÔN HÓA I. Lý thuyết Quá trình amôn hóa là quá trình phân giải protein và các hợp chất hữu cơ khác có chứa nitơ tạo thành amoniac. Các vi sinh vật có khả năng amôn hóa bao gồm nhiều loài sinh bào tử hoặc không sinh bào tử, có khả năng sử dụng nhiều nguồn vật chất khác nhau. Ngoài ra còn nhiều loại xạ khuẩn và nấm khuẩn ty. Tuy vậy, những vi sinh vật chỉ sử dụng riêng một loại protein thì không nhiều. Các vi sinh vật này có khả năng tiết men phân giải protein vào môi trường, thủy phân thành các amino acid. Khi đó, chúng sử dụng các amino acid này trong quá trình dị hóa và đổng hóa. Các sản phẩm đặc trưng của quá trình phân giải protein là NH 3 và H 2 S. Quá trình phân giải protein có thể xảy ra trong các điều kiện hiếu khí và kỵ khí. Trong điều kiện hiếu khí, các hợp chất hữu cơ có chứa nitơ được phân giải bởi các loài trong giống Bacillus và Pseudomonas, các đại diện trong họ Enterobacteriaceae, các xạ khuẩn và nấm khuẩn ty. Trong đó, vai trò quan trọng và chủ yếu nhất là giống Bacillus. Trong điều kiện kỵ khí thì các loài trong giống Clostridium tham gia quá trình chuyển hóa này. Còn trong điều kiện thông khí hạn chế, quá trình amôn hóa được thực hiện bới các loài vi khuẩn và trực khuẩn kỵ khí tùy nghi. II. Thực hành Việc phát hiện và xác định số lượng các vi sinh vật amôn hóa được thực hiện bằng cách cấy các mẫu phân tích vào môi trường lỏng và rắn canh thịt-peptone. Việc cấy lên môi trường thạch được tiến hành bằng dịch huyền phù đã thanh trùng Pasteur nhằm tiêu diệt các tế bào sinh dưỡng và chỉ còn giữ lại bào tử của các đại diện thuộc giống Bacillus – giống đặc trưng nhất cho quá trình amôn hóa. Ngoài ra, việc cấy lên môi trường thạch cho phép nhận định được các đặc tính khác nhau của khuẩn lạc các vi khuẩn khác nhau này. 1. Môi trường - hóa chất Môi trường canh thịt- peptone: Cao thịt 5g Peptone 10g Nước 1000ml Môi trường thạch: Trộn vào môi trường lỏng 2% thạch. 4 Dung dịch pha loãng mẫu: dung dịch nước muối sinh lý tiệt trùng. Giấy lọc loại thấm acetate chì Giấy quỳ đỏ Các loại thuốc nhuộm quan sát vi sinh vật: thuốc nhuộm Gram và thuốc nhuộm bào tử, Thuốc thử Nessler 2. Dụng cụ Các dụng cụ pha chế môi trường Các dụng cụ cấy, khử trùng Kinh hiển vi 3. Tiến hành thí nghiệm Chuẩn bị môi trường: Môi trường canh thịt-peptone được phân vào khoảng 1/3 chiều cao ống nghiệm, khử trùng ở 1 atm, 15 min. Các dải giấy quỳ và giấy lọc thấm acetat chì được cho vào đĩa petri, hấp khử trùng ở 0,5 atm. Môi trường thạch canh thịt-peptone: sau khi hấp khử trùng được phân vào các đĩa petri, giữ ở 30 O C Chuẩn bị mẫu: Mẫu đất được pha với nước để thu dịch huyền phù • Ủ vi sinh vật trên môi trường lỏng: Cấy từ các dịch pha loãng nồng độ 10 5 – 10 10 Lấy 1ml dịch pha loãng cấy vào ống nghiệm có chứa môi trường canh thịt-peptone đã khử trùng ở trên Dùng kẹp lấy các dải giấy quỳ và giấy lọc thấm acetatechì gài vào giữa nút bông và ống nghiệm Ủ ở nhiệt độ 28-30 O C trong 3 ngày đêm. • Ủ vi sinh vật trên môi trường thạch: Cấy từ các dịch pha loãng nồng độ 10 2 – 10 5 Lấy 0,5ml dịch pha loãng cho vào các đĩa petri có chứa môi trường đã khử trùng ở trên Dùng que trang trải đều lên bề mặt thạch Ủ ở nhiệt độ 28-30 O C trong 3 ngày đêm. Mỗi môi trường tiến hành thêm 1 mẫu đối chứng 5 4. Quan sát và ghi nhận kết quả Đối với môi trường lỏng, quan sát: Sự đục môi trường Sự tạo bông, kết cạn Nổi váng trên bề mặt Phản ứng sinh hóa: Màu kết tủa với thuốc thử Nessler: Nhỏ một giọt thuốc thử Nessler lên đĩa sứ trắng, thêm một que cấy đầy đất vườn ủ trong peptone broth. Quan sát màu kết tủa: Màu vàng nhạt – ít ammoniac Vàng sậm – nhiều ammoniac Nâu – rất nhiều ammoniac Sự sinh NH 3 làm giấy quỳ hóa xanh Sự sinh H 2 S làm giấy lọc thấm acetate chì hóa đen. So sánh đối chứng và thí nghiệm. Độ pha loãng Đục môi trường Tạo bông Tạo cặn Sinh NH 3 Sinh H 2 S Nhận xét mức độ, tỷ lệ xuất hiện cao nhất trong 1g mẫu Chọn một độ pha loãng có tỷ lệ vi sinh vật cao nhất làm tiêu bản và soi kính hiển vi Trên môi trường thạch, ghi nhận: Số lượng khuẩn lạc trên 1 đĩa ở mỗi độ pha loãng Số khuẩn lạc đặc trưng Quan sát hình thái khuẩn lạc, mô tả, ghi nhận vào bảng Độ pha loãng Số khuẩn lạc Số khuẩn lạc đặc trưng Hình thái khuẩn lạc Xuất hiện bào tử Khả năng di động Chọn một đĩa có nhiều khuẩn lạc đặc trưng nhất làm tiêu bản và soi kính hiển vi So sánh hình thái quan sát được giữa tiêu bản từ môi trường lỏng và môi trường thạch 6 BÀI 2: VI KHUẨN NITRAT HÓA I. Lý thuyết Nitrat hóa là quá trình oxi hóa NH 3 thành HNO 3 , cung cấp năng lượng cho vi sinh vật hoạt động. Quá trình oxi hóa này xảy ra cùng với quá trình đồng hóa CO 2 . Hầu hết các vi sinh vật tự dưỡng hóa năng vô cơ thuộc loại hiếu khí bắt buộc đều có khả năng thực hiện quá trình này. Nitrat hóa qua 2 giai đoạn: Đầu tiên là giai đoạn oxi hóa NH 3 thành nitrit bởi một số đại diện thuộc nhóm vi khuẩn nitrit hóa: Nitrosomonas, Nitrosocystis, Nitrosococcus, Nitrosolobus, Tất cả chúng đều giống nhau về mặt sinh lý, sinh hóa, chỉ khác nhau về mặt hình thái học và cấu trúc tế bào. Các đại diện của giống Nitrosomonas không sinh nội bào tử, tế bào nhỏ bé hình bầu dục. Trên môi trường lỏng, Nitrosomonas trải qua một số pha, phát triển tùy thuộc một số điều kiện. Hai pha chủ yếu là pha di động- tế bào có 1 hay chùm tiên mao và pha tập đoàn khuẩn keo-các tế bào không di động. Giai đoạn 2 của quá trình nitrat hóa oxi hóa nitrit thành nitrat bởi một số vi khuẩn: Nitrobacter winogradski, N. agilis, Nitrospina gracilis, Nitrococcus mobilis. Tế bào đặc trưng của Nitrobacter trong dịch nuôi thường có dạng hình que tròn, hình hạt đậu, hoặc hình trứng, có thể di động hoặc không di động. Khi điều kiện không thuận lợi chúng có thể hình thành những tập đoàn khuẩn keo. Nitrospina gracilis là những trực khuẩn thẳng, mảnh dẻ, thỉnh thoảng có dạng hình cầu, không di động, và có đặ trưng là hình thành những tập đoàn khuẩn keo. Nitrococcus mobilis thì có dạng hình tròn, có tiên mao. Vi khuẩn nitrat hóa không sử dụng các chất hữu cơ và chuyển hóa một cách chặt chẽ đối với việc oxi hóa cơ chất-NH 3 và nitrit II. Thực hành Việc phát hiện và xác định số lượng vi khuẩn nitrat hóa được thực hiện bằng cách cấy dịch huyền phù cần phân tích lên môi trường chọn lọc vô cơ Winogradski. Nguồn C duy nhất trong môi trường này là CO 2 có trong không khí và trong thành phần của CaCO 3 . Nguyên liệu năng lượng và nguồn N cho các vi khuẩn gây ra giai đoạn đầu của quá trình nitrat hóa là NH 3 và muối amon, còn đối với vi khuẩn gây ra giai đoạn hai là nitrit. 7 Điều kiện cần thiết đối với sự phát triển của vi khuẩn nitrat hóa là việc thông khí đầy đủ vào môi trường nuôi cấy. Số lượng vi khuẩn nitrat hóa được xác định bằng phương pháp pha loãng tới hạn. 1. Môi trường- hóa chất Thành phần môi trường Winogradski: (NH4) 2 SO 4 2 g/l K 2 HPO4 1 g/l MgSO4 0,5 g/l FeSO4 0,4 g/l NaCl 2 g/l Chia vào các bình thủy tinh 50ml, cho vào mỗi bình một ít CaCO 3 . Hấp khử trùng ở 1 atm Dung dịch pha loãng mẫu Các loại thuốc nhuộm quan sát vi sinh vật Tinh thể diphenylamin H 2 SO 4 đậm đặc 2. Tiến hành thí nghiệm Chuẩn bị môi trường: Môi trường đã hấp khử trùng được phân vào các ống nghiệm Xác định vi sinh vật trên môi trường lỏng: Pha loãng mẫu 10 2 - 10 5 Mỗi độ pha loãng lấy 1ml mẫu cấy vào ống nghiệm có chứa môi trường đả khử trùng ở trên Ủ ở 28-30 O C trong 2-3 tuần Làm 1 ống nghiệm đối chứng 3. Quan sát và ghi nhận kết quả: Ở mỗi độ pha loãng, ghi nhận sự thay đổi môi trường trong ống nghiệm Những ống nghiệm nào ghi nhận có vi khuẩn phát triển, cần tiến hành thử nghiệm định tính. Phản ứng định tính nitrat: Lấy vài tinh thể diphenylamin hòa tan trong 1 giọt H 2 SO 4 đậm đặc. Sau đó thêm 1 giọt dịch cần kiểm tra. Tiến hành trên bản sứ trắng sẽ thấy xuất hiện màu xanh thẩm. Ghi nhận kết quả vào bảng Ống nghiệm số Độ pha loãng 10 2 10 3 10 4 10 5 NO 2- NO 3- NO 2- NO 3- NO 2- NO 3- NO 2- NO 3- 8 Chọn ống nghiệm có kết quả dương tính làm tiêu bản quan sát dưới kính hiển vi. Cần lưu ý chọn được cả những hạt CaCO 3 , vì xung quanh hạt này, tỷ lệ vi khuẩn là cao nhất. Miêu tả, so sánh hình thái các tế bào vi khuẩn quan sát được (hình dạng, khả năng di động, khả năng tạo tập đoàn khuẩn keo). Nhận xét loài nào chiếm ưu thế nhất. 9 BÀI 3. VI KHUẨN PHẢN NITRAT HÓA I. Lý thuyết Phản nitrat hóa là quá trình vi sinh vật thực hiện việc khử nitrat thành nitrogen phân tử, đồng thời oxi hóa các chất hữu cơ như đường, rượu, axit hữu co thành CO 2 và H 2 O với chất nhận điện tử cuối cùng là NO 3 . Năng lượng sinh ra khi oxi hóa cơ chất được vi sinh vật sử dụng trong quá trình hoạt động sống của mình. Quá trình phản nitrat hóa có thể xảy ra trong điều kiện hiếu khí lẫn kỵ khí, nhưng đặc biệt mạnh trong điều kiện kỵ khí. Các vi sinh vật thực hiện quá trình này phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên. Phần lớn chúng thuộc loại dị dưỡng hóa năng hữu cơ, kỵ khí tùy nghi gồm một số giống Pseudomonas, Achromobacter, Micrococcus … II. Thực hành Việc phát hiện vi khuẩn phản nitrat hóa và xác định số lượng của chúng được thực hiện bằng phương pháp cấy mẫu lên môi trường chứa hợp chất C ở dạng oxi hóa, có nitrat và các hợp chất khác cần cho quá trình sinh tổng hợp của tế bào. Khi đó, đáng chú ý là một số vi khuẩn nitrat sử dụng nitrat như nguồn năng lượng chủ yếu hoặc duy nhất, tức dùng chúng làm chất nhận electron nhưng không dùng làm nguồn N trong trao đổi kiến tạo, vì không thể khử NH3 thành NH4 + . Vì vậy, trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn phản nitrat hóa, người ta cho thêm peptone, asparagin hoặc muối amon và hạn chế lưu khí trong quá trình nuôi cấy. Số lượng vi khuẩn được xác định bằng phương pháp pha loãng tới hạn. 1. Môi trường- hóa chất Môi trường Giltay: Dung dịch A: Asparagine: 1g KNO 3 : 1g Nước máy: 0.25l Dung dịch B: KNO 3 : 8,5g K 2 HPO 4 : 1g MgSO 4 : 1g 10 [...]... hiển vi vật kính 40X đề kiểm tra hình thái vi khuẩn: kích thước lớn, thường ứng thành đôi và có bao nhầy Ghi nhận các đặc điểm này vào bảng Hình dạng tế bào Bào tử Kích Sự sắp Bao Hình thước xếp tế nhầy vẽ tế bào bào Loại 1 Loại 2 BÀI 5 :VI SINH VẬT PHÂN GIẢI CELLULOSE I Lý thuyết 14 Cellulose là thành phần cấu tạo cơ bản của thành tế bào thực vật Vi c tổng hợp cellulose có quy mô phức tạp hơn hẳn vi c... Tiến hành thí nghiệm - Giai đoạn tăng sinh: Cân 1g đất cho vào erlen có 50ml môi trường Thompson-Sherman tăng sinh đã hấp khử trùng với thành phần như trên Ủ 4-7 ngày 30OC - Giai đoạn sau tăng sinh: Kiểm tra hình dạng, kích thước tế bào vi khuẩn có trong sinh khối đã tăng sinh dưới kính hiển vi quang học Nếu có đúng hình thái khuẩn lạc, chuyển sang môi trường phân lập 13 - Giai đoạn phân lập: Cấy sinh. .. tạo tế bào Các vi sinh vật cố định N sống tự do, có nhiều trong đất, nước gồm một số loài thuộc giống Clostridium, Azotobacter, Pseudomonas, Bacillus, Aerobacter, vi khuẩn quan năng, vi khuẩn sinh metan, vi khuẩn khử sulfat, nấm, tảo lam… Ngoài ra khả năng cố định N còn có ở các vi khuẩn nốt sần sống cộng sinh trong rễ các cây họ đậu Chúng có ý nghĩa quan trong trong vi c chuyển N vô cơ thành N hữu cơ,... thái học của các vi khuẩn phản nitrat hóa phân lập được Kiểm tra vi c khử nitrat trong môi trường bằng phản ứng sinh hóa với diphenylamin: Lấy vài tinh thể diphenylamine hòa tan vào một giọt H2SO 4 đặc, sau đó thêm vào một giọt dịch nghiên cứu Nếu có mặt nitrate sẽ xuất hiện màu xanh thẫm 11 BÀI 4 VI SINH VẬT CỐ ĐỊNH NITƠ I Lý thuyết Cố định N là khả năng đồng hóa N phân tử của một số vi sinh vật và dùng... cellobioase và glucose Vi sinh vật dùng các hợp chất sinh ra này làm nguồn cacbon và nguồn năng lượng Trong điều kiện hiếu khí, các vi sinh vật tham gia vào quá trình này gồm niêm khuẩn, một số đại diện của các vi khuẩn không sinh bào tử và sinh bào tử, xạ khuẩn, nấm Trong đó, quan trọng nhất là niêm khuẩn Niêm khuẩn có tế bào hình que nhỏ bé (03-0,4 x 0,7-10μm) hơi uốn cong, thường có đầu nhọn, thành tế bào... trò của vi khuẩn nốt sần, các loài trong giống Clostridium và Azotobacter II Thực hành Các loài Azotobacter thuộc loài vi sinh vật cố định nitrogen hoạt động nhất Một số loài được nghiên cứu hơn cả là Az Chroococum-đặc trưng trên đất đồng cỏ, Az Agilis và Az Vinelandii trong ao hồ Các loài này khác nhau về đặc điểm sinh trưởng trên môi trường đặc, kích thước, hình thái tế bào và một số đặc điểm sinh lý... khác Do đó, vi sinh vật phân giải cellulose có vai trò đặc biệt quan trọng trong chu trình tuần hoàn Cacbon Sự phân giải tiến hành trong điều kiện hiếu khí lẫn kỵ khí, môi trường kiểm hoặc acid, độ ẩm thấp hoặc cao và ở các nhiệt độ khác nhau Tất cả vi sinh vật tham gia vô cơ hóa cellulose đều thuộc loại dị dưỡng hóa năng hữu cơ, có enzyme cellulosase xúc tác vi c phân giải cellulose thành cellobioase... phát triển của vi khuẩn nitrat hóa là sự sinh khí, làm đục và giảm pH của môi trường Quan sát các ống nghiệm ở các độ pha loãng khác nhau và ghi nhận vào bảng Kiểm tra vi c khử nitrat trong môi trường bằng phản ứng sinh hóa với diphenylamin Độ pha loãng 103 105 107 109 Đục môi trường Sinh khí pH môi trường NO3- Chọn 1 ống nghiệm cho kết quả tốt nhất làm tiêu bản, quan sát kính hiển vi và ghi nhận hình... đầu nhọn, không sinh vi kén Các loài trong giống Sporocytophaga có hình thái tương tự như Cytophaga nhưng khác ở chỗ có khả năng sinh vi kén Các loài thuộc giống Sorangium là những trực khuẩn đầu nhọn, có khả năng hình thành kén Trên bề mặt vật liệu có cellulose, niêm khuẩn phát triển trong dạng thể nhầy, không có hình dạng xác định, lan rộng, không màu hoặc có màu vàng, da cam, đỏ tương ứng với chỗ cellulose... kết quả Quan sát và đếm số lượng khuẩn lạc vi sinh vật mọc được trên khoanh giấy lọc trong mỗi đĩa petri Xác định xem khuẩn lạc là của nhóm vi sinh vật nào (niêm khuẩn, xạ khuẩn hay nấm khuẩn ty) chiếm ưu thế trên giấy lọc Để phân biệt các khuẩn lạc nhỏ của xạ khuẩn và nấm, có thể quan sát trên kính hiển vi với vật kính 8X Nhận xét sự khác nhau giữa các loại vi sinh vật phát hiện được Khuẩn lạc loại Hình . CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÀI GIẢNG THỰC HÀNH VI SINH ỨNG DỤNG Biên soạn: TS. Nguyễn Hoài Hương 1 - 2009 - 2 Giới thiệu môn học Môn thực hành vi sinh ứng dụng nhằm. danh chúng là bước đầu đưa chúng vào ứng dụng. Trong khuôn khổ bài thực hành môn vi sinh ứng dụng sinh vi n phân lập vi sinh vật chủ yếu từ môi trường đất.