Xác định tác nhân gây bệnh và nghiên cứu thử nghiệm một số loại thảo dược trong phòng trị bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)

Xác định tác nhân gây bệnh và nghiên cứu thử nghiệm một số loại thảo dược trong phòng trị bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM HUẾKHOA THỦY SẢN

TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei)

Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thế Vương

Năm 2009

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp, ngoài sự cố gắng của bản thân, em được sựgiúp đỡ của rất nhiều thầy cô giáo Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến trườngĐại học Nông lâm Huế, Ban chủ nhiệm Khoa Thủy sản, bộ môn Ngư Y, Phòngthí nghiệm Khoa thủy sản đã tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành chươngtrình thực tập.

Đặc biệt, xin chân thành cảm ơn Thầy giáo Nguyễn Anh Tuấn, đã tận tình hướngdẫn, chỉ dạy trong suốt quá trình thực tập cuối khóa và hoàn thành bài khóa luận.Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tất cả thấy cô giáo Khoa Thủy sản Trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp, mặc dù đã có rất nhiều cố gắng, tuynhiên do thời gian có hạn và kiến thức còn hạn chế nên không thể tránh đượcnhững sai xót Rất mong được sự quan tâm, góp ý của thầy cô để khóa luận hoànthiện hơn.

Em xin chân thành cảm ơn!

Huế, ngày 25 tháng 5 năm 2009 Sinh viên

Nguyễn Thế Vương

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU, ĐỒ THỊ

DANH MỤC CÁC HÌNH

PHẦN 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

PHẦN 2 TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 3

2.1 Tình hình dịch bệnh tôm tại Việt Nam và Thừa Thiên Huế 3

2.1.1 Tại Việt Nam 3

2.1.2 Tại Thừa Thiên Huế 5

2.2 Tình hình nghiên cứu bệnh vi khuẩn trên tôm của thế giới và Việt Nam 6

2.2.1 Trên thế giới 6

2.2.2 Tại Việt Nam 8

2.3 Tình hình sử dụng hợp chất chiết xuất từ thảo dược 10

2.3.1 Trên thế giới 10

2.3.2 Tại Việt Nam 12

2.4 Một số thảo dược sử dụng trong nuôi trồng thủy sản 14

PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 16

3.2 Đối tượng nghiên cứu 16

3.2.1 Tôm Thẻ Chân Trắng Penaeus Vannamei 16

3.2.2 Các loại thảo dược 17

3.3 Nội dung nghiên cứu 19

3.4 Dụng cụ - Hoá chất - Môi trường 19

3.4.1 Dụng cụ thí nghiệm 19

3.4.2 Môi trường , hoá chất 19

3.5 Phương pháp nghiên cứu 21

3.5.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 21

3.5.2 Phương pháp thu mẫu 21

3.5.3 Phương pháp nuôi cấy phân lập, định danh vi khuẩn 22

3.5.4 Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn 26

3.5.5 Phương pháp chiết xuất thảo dược 27

3.5.6 Phương pháp thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của thảo dược 27

3.6 Phương pháp xử lý số liệu 27

PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 28

4.1 Trọng lượng, chiều dài tôm thẻ chân trắng bị bệnh 28

4.2 Kết quả phân lập, định danh vi khuẩn gây bệnh 28

4.2.1 Kết quả quan sát dấu hiệu bệnh lý 28

4.2.2 Kết quả phân lập, định danh vi khuẩn 29

4.3 Kết quả thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các loại thảo dược 31

4.3.1 Khả năng kháng khuẩn của tỏi đối với các chủng vi khuẩn phân lập được 32Trang

4.3.2 Khả năng kháng khuẩn của hợp chất tỏi, lá húng (tỉ lệ 1:1) đối với các

chủng vi khuẩn phân lập được 34

4.3.3 Khả năng kháng khuẩn của diếp cá đối với các chủng vi khuẩn phân lập được 37

4.3.4 Khả năng kháng khuẩn của rau má đối với các chủng vi khuẩn phân lập được 38

4.4 Kết quả so sánh khả năng kháng khuẩn của mỗi loại thảo dược đối với các chủng vi khuẩn phân lập được 40

4.5 Kết quả so sánh khả năng kháng khuẩn giữ các loại thảo dược khác nhau đối với các chủng vi khuẩn phân lập được 41

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU, ĐỒ THỊ

Bảng 4.1 Trọng lượng, chiều dài mẫu tôm bị bệnh 28

Bảng 4.2 Kết quả phân lập và định danh vi khuẩn gây bệnh trên tôm thẻ chântrắng 39

Bảng 4.3 Khả năng kháng khuẩn của diếp đối với V.alginolyticus 37

Bảng 4.4 Khả năng kháng khuẩn của diếp cá đối với Vibrio harvey 37

Bảng 4.5 Khả năng kháng khuẩn của rau má đối với Vibrio alginolyticus 38

Bảng 4.6 Khả năng kháng khuẩn của rau má đối với Vibrio harvey 39

Bảng 4.7 So sánh khả năng kháng khuẩn của thảo dược đối với các chủng vi khuẩnphân lập được 40

Sơ đồ 3.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 21

Sơ đồ 3.2 Sơ đồ xác định mật độ vi khuẩn 26

Đồ thị 4.1 Khả năng kháng khuẩn của tỏi đối với Vibrio alginolyticus 32

Đồ thị 4.2 Khả năng kháng khuẩn của tỏi ở đối với Vibrio harveyi 32

Đồ thị 4.3 Khả năng kháng khuẩn của hợp chất tỏi, lá húng (tỷ lệ 1:1) đối vớiVibrio alginolyticus 35

Đồ thị 4.4 Khả năng kháng khuẩn của hợp chất tỏi, lá húng ( tỷ lệ 1:1) đối vớiVibrio harvey 35

Đồ thị 4.5 Khả năng kháng khuẩn của các loại thảo dược khác nhau đối với Vibrio alginolyticus 41

Đồ thị 4.6 So sánh khả năng kháng khuẩn của các loại thảo dược đối với Vibrioharvey 42

Hình 3.6 Cân trọng lượng, đo chiều dài tôm bị bệnh 21

Hình 3.7 Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của thảo dược 27

Hình 4.1 Dấu hiệu bên ngoài của tôm bị bệnh 28

Hình 4.2 Vibrio alginolyticus 30

Hình 4.3 Vibrio harveyi 30

Hình 4 4 Khuẩn lạc của vi khuẩn Vibrio alginolyticus trên môi trường TCBS 31

Hình 4 5 Khuẩn lạc của vi khuẩn Vibrio harveyi trên môi trường TCBS 31

Hình 4.6 Kết quả tạo vòng kháng khuẩn của tỏi khi thử nghiệm trênV.alginolyticus 33

Hình 4.7 Kết quả tạo vòng kháng khuẩn của tỏi khi thử nghiệm trên V.harveyi 33

Hình 4.8 Kết quả tạo vòng kháng khuẩn của hợp chất tỏi, lá húng khi thử nghiệmtrên V.alginolyticus 36

Hình 4.9 Kết quả tạo vòng kháng khuẩn của các thảo dược 43

PHẦN 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngành Nuôi trồng thủy sản Việt Nam ngày càng phát triển, trở thànhngành kinh tế mũi nhọn của quốc gia, không chỉ mang lại nhiều ngoại tệ cho đấtnước mà còn góp phần đáng kể vào sự thành công trong công tác xóa đói giảmnghèo, bảo đảm an ninh lương thực, làm thay đổi đời sống dân cư các vùng miềnnúi và ven biển [4]

Tuy nhiên, trong những năm gần đây, dịch bệnh và ô nhiễm môi trườngđang trở thành những thách thức lớn đối với ngành Nuôi trồng thủy sản Thiệthại do dịch bệnh gây ra trên tôm sú tăng từ 0,5 tỉ USD năm 1995 - 1997 lên đến1,5 tỉ USD trong giai đoạn 2001 – 2002 Trong số những tác nhân gây bệnh trênđộng vật thủy sản, bệnh do vi khuẩn gây ra chiếm tỷ lệ khá lớn Điều này đã cảntrở việc phát triển công nghiệp sản xuất giống thủy sản cũng như nuôi thươngphẩm [7], [19]

Một khi nuôi trồng thủy sản đã phát triển ở mức công nghiệp, thì kỹ thuậtquản lý môi trường và dịch bệnh đã trở thành các bí quyết quan trọng để đảmbảo sự thành công của một vụ nuôi Thông thường, để hạn chế dịch bệnh do vikhuẩn người nuôi thường sử dụng kháng sinh, các loại hóa chất đặc trị Tuynhiên, việc sử dụng hóa chất, kháng sinh không đúng quy cách, không đúng liềulượng đã gây lên tác hại lớn như là tạo ra các dòng vi khuẩn kháng thuốc, làmsuy thoái môi trường, ảnh hưởng không tốt tới sức khỏe con người [10], [14],[15] Hơn nữa hiện nay theo các quy định về an toàn thực phẩm, nghiêm cấm sựtồn dư các loại hóa chất, kháng sinh có trong động vật thủy sản Chính vì thếchúng ta cần có biện pháp tốt để vượt qua những rào cản này [7]

Những năm gần đây xu hướng sử dụng thảo dược trong chữa trị bệnh trênđộng vật thủy sản được xem như một giải pháp có biên độ an toàn cao trong bảoquản, điều trị bệnh nấm và vi khuẩn gây ra trên động vật thủy sản [9]

Từ đó, đề tài “Xác định tác nhân gây bệnh và nghiên cứu thử nghiệm

một số loại thảo dược trong phòng trị bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân

PHẦN 2 TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU2.1 Tình hình dịch bệnh tôm tại Việt Nam và Thừa Thiên Huế

2.1.1 Tại Việt Nam

Năm 1990, Việt Nam có hơn 187.000 ha mặt nước nuôi tôm với sản lượngđạt được khoảng 31.000 tấn Năm 1995, diện tích nuôi tăng lên 260.000 ha, sảnlượng đạt được 52.000 tấn Nhưng mặt trái của sự phát triển nhanh chóng, khôngquy hoạch đã dẫn đến dịch bệnh bùng phát ở nhiều nơi Năm 1994, dịch bệnhbùng phát tại Đồng bằng sông Cửu Long: Trà Vinh, Bến Tre, Sóc Trăng, LongAn, Nha Trang … gây thiệt hại hàng chục tỷ đồng cho bà con nuôi tôm [7]

Năm 1996, tại các tỉnh miền Nam (từ Phú Yên đến Cà Mau) dịch bệnh đãxảy ra trên 84.917 ha, trong đó nuôi quảng canh: 52.017 ha, quảng canh cải tiến:29.011 ha, bán thâm canh: 3.829 ha Tổng thiệt hại lên đến hàng chục tỷ đồng.Các tỉnh bị dịch bệnh nặng như Cà Mau hơn 70.000 ha, Kiên Giang hơn 4.000ha, Bến Tre hơn 3.000 ha [7]

Năm 1997, theo ước tính của Nguyễn Việt Thắng (báo cáo nghiên cứukhoa học) tỉnh Bến Tre bị thiệt hại nặng nề nhất với 20% tôm thả bị chết, TràVinh với hơn 15% tôm thả bị chết Cũng trong thời gian này dịch bệnh bùngphát nghiêm trọng ở các tỉnh Miền Trung, đặc biệt vào tháng 2-3 Tổng số diệntích bị bệnh chiếm khoảng 80% tổng diện tích nuôi trồng gây thiệt hại lớn chocác tỉnh miền Trung [20]

Báo cáo kết quả Nuôi trồng thủy sản năm 2003 của ngành đã đưa ra vàicon số: Cả nước có 546.757 ha nuôi tôm nước lợ thương phẩm, trong đó diệntích bị bệnh khoảng 30.083 ha Riêng các tỉnh thành ven biển từ Ðà Nẵng đếnKiên Giang có tới 29.200 ha nuôi tôm bị chết, chiếm 97,06% diện tích có tôm bịchết trong cả nước Các bệnh xảy ra với tôm chủ yếu là đốm trắng (WSSV),bệnh MBV (Monodon Baculovirus), bệnh do vi khuẩn vibrio, bệnh do ký sinhtrùng, gần đây xuất hiện thêm bệnh phân trắng, teo gan ở một vài nơi Tại cáctỉnh Bắc Trung Bộ, theo báo cáo của Viện nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản I chothấy: Thanh Hóa có hơn 40% diện tích nuôi tôm bị nhiễm virut đốm trắng, tậptrung ở vùng nuôi tôm công nghiệp như Khu công nghiệp Hoằng Phụ, với

70/110 ha nuôi tôm bị nhiễm bệnh Nghệ An có 47,8% diện tích nuôi tôm nhiễmvirus đốm trắng; 30,4% bệnh MBV; 54,5% bệnh đầu vàng Ở Hà Tĩnh, trong số150 ha nuôi tôm bị bệnh, có 67 ha nhiễm bệnh virus đốm trắng, trong đó 27 hacó tôm nuôi chết hoàn toàn Ở các tỉnh Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa ThiênHuế, cũng có từ xấp xỉ trăm ha cho tới vài trăm ha nuôi tôm bị bệnh.[18]

Tại các tỉnh miền Trung, Nam Trung Bộ, theo Phòng bệnh học thủy sản Trung tâm nghiên cứu Thủy sản III, Khánh Hòa có tỷ lệ diện tích nuôi tôm bịbệnh thấp nhất 14,3%, cao nhất ở Ninh Thuận 52,4% Tỷ lệ nhiễm virus đốmtrắng ở tôm nuôi tại khu vực này tuy có giảm nhưng bệnh phân trắng, teo gan lạixảy ra hầu hết ở các vùng nuôi trọng điểm như Ninh Hải, Phan Rang, NinhPhước có những nơi lên tới 90-95% tôm bị nhiễm bệnh.[18]

-Theo kết quả nghiên cứu của Viện nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản II, tạicác tỉnh Nam Bộ tỷ lệ nhiễm bệnh virus đốm trắng trên mẫu tôm ở ao nuôiquảng canh cải tiến chiếm tới 56%, 50% tôm nhiễm bệnh MBV Bệnh virus đốmtrắng gây chết tôm hàng loạt, tác hại lớn đến năng suất, sản lượng tôm của khuvực.[18]

Năm 2007, dịch bệnh đã bùng phát trên hơn 30 ha ao nuôi tôm trên cát ởhuyện Phù Mỹ (Bình Định) Tôm chết chủ yếu ở giai đoạn 30 - 40 ngày nuôi gâytổn thất hàng chục tỉ đồng Năm 2005, vùng nuôi tôm trên cát trọng điểm tỉnhBình Định tập trung tại hai xã Mỹ An, Mỹ Thắng (Phù Mỹ) cũng xảy ra dịchbệnh.[19]

Những tháng đầu năm 2008, một số tỉnh nuôi tôm ở Đồng Bằng Sông CửuLong như: Kiên Giang, Bến Tre, Trà Vinh, Cà Mau bị thiệt hại nặng do tôm chếthàng loạt Nghiêm trọng nhất tại Cà Mau có khoảng 34.000 ha tôm bị nhiễmbệnh, thiệt hại từ 10% đến 70% Việc tăng trưởng quá nhanh chóng về diện tíchnuôi tôm đã nảy sinh nhiều bất cập về ô nhiễm, kiểm soát dịch bệnh, chất lượngsản phẩm dẫn đến thiệt hại không nhỏ về kinh tế cũng như môi trường [20]

2.1.2 Tại Thừa Thiên Huế

Năm 2007, diện tích nuôi tôm của Thừa Thiên Huế khoảng 3.712,1 ha Ởvụ nuôi này thời tiết diễn biến phức tạp, nắng nóng kéo dài xen giữa có 3 đợt giómùa kèm theo mưa dẫn đến nhiệt độ, các yếu tố môi trường biến động quá caorất bất lợi cho sự phát triển tôm nuôi Qua kiểm tra cho thấy tôm bị nhiễm virusđốm trắng ở các vùng Quảng An, Quảng Phước huyện Quảng Điền Sau đó dịchbệnh lây lan trên diện rộng ở các xã thuộc huyện Phú Lộc, Phú Vang Theo

thống kê diện tích tôm bệnh: Khoảng 1.052,98 ha chiếm tỷ lệ 36,91% tổng diện

tích nuôi, tăng 31,28% so với năm 2006 Huyện Phú Lộc có diện tích nuôi tômlớn nhất với 900 ha, cũng là huyện thiệt hại nặng nhất với 600 ha bị bệnh, chiếmtỷ lệ 66,67% tổng diện tích nuôi Trong đó bệnh đốm trắng trên 138,83 ha chiếmtỷ lệ 11,07% tổng diện tích nuôi, các bệnh vi khuẩn khác trên 166,7 ha chiếm tỷlệ 14,37% Huyện Phong Điền thiệt hại thứ hai, với 22,9 ha nhiễm bệnh, chiếm39,76% Trong đó bệnh đốm trắng xảy ra với tỷ lệ rất cao, trên 21 ha, chiếm38,02% Hai huyện Phú Vang và Quảng Điền cũng bị thiệt hại nặng, với tỉ lệ xấpxỉ 26% Bệnh đốm trắng ở Phú Vang chiếm 11,9 %, bệnh vi khuẩn khác chiếm14,37% Tỷ lệ này ở Quảng Điền là 25,46% và 0,12% Huyện Hương Trà códiện tích nuôi tôm thấp nhất với 276 ha, đồng thời tỷ lệ xảy ra bệnh thấp nhất với4,5 ha chiếm tỷ lệ 1,63% Đặc biệt ở Hương Trà bệnh đốm trắng hầu như khôngxảy ra.[20]

Trong báo cáo tình hình sản xuất nông nghiệp của sở Nông nghiệp, tínhđến ngày 27/11/2008 toàn tỉnh có 112,1 ha nuôi tôm thẻ chân trắng đạt sản lượng1.208,9 triệu tấn với diện tích bị bệnh 4 ha chiếm 1,28% diện tích nuôi Diện tíchnuôi tôm sú lớn hơn với 3609,2 ha đạt sản lượng 2560,35 triệu tấn, trong đó diệntích bị bệnh khoảng 166,05 ha chiếm 4,62% Qua thống kê cho thấy tỷ lệ bị bệnhcủa tôm sú cao hơn tôm thẻ chân trắng Điều này chứng tỏ tôm thẻ có sức đềkháng, thích nghi với môi trường tốt hơn tôm sú Năm 2008, tình hình thời tiếtdiễn biến ít bất lợi, người nuôi đã có kế hoạch phòng bệnh nên tỷ lệ bị bệnh giảmđáng kể so với năm 2007.

2.2 Tình hình nghiên cứu bệnh vi khuẩn trên tôm của thế giới và Việt Nam

2.2.1 Trên thế giới

Bệnh truyền nhiễm được xem như yếu tố quan trọng nhất góp phần làmgiảm sút sản lượng tôm nuôi Việc khống chế các mầm bệnh bằng cách dùng hóachất theo phương pháp truyền thống cho thấy ngày càng mang lại hiệu quả thấpđối với các mầm bệnh mới xuất hiện Điều này tạo điều kiện cho công nghệ sinhhọc gia tăng vai trò hữu hiệu của mình trong chẩn đoán các mầm bệnh, giải thíchrõ quá trình phát sinh bệnh, phát triển các phương thức chẩn đoán, phòng ngừahữu hiệu đối với dịch bệnh (Subasinghe, 1998) Hiện nay bệnh truyền nhiễm donhóm vi khuẩn phát sáng, nhóm virus MBV (Monodon Baculovirus), YHV(Yellow Head Virus), WSSV (White Spot Syndrom Virus) được xem là tác nhângây bệnh đáng được quan tâm nhất đã làm ảnh hưởng đến sản lượng tôm nuôihàng năm [20]

Đối với bệnh do vi khuẩn gây nên, các nghiên cứu cho thấy trong hệthống nuôi kín hoặc tuần hoàn sẽ làm gia tăng khả năng nhiễm các bệnh do vikhuẩn Mặt khác, nhằm hạn chế việc đưa các chất hữu cơ trong ao nuôi tôm làmô nhiễm môi trường vùng duyên hải, việc phát triển hệ thống nuôi hoặc hoàntoàn không thay nước hoặc nuôi theo phương pháp tuần hoàn cũng rất cần thiết(Nygaard, 1992) Tuy nhiên trong hệ thống kín hoặc tuần hoàn sẽ làm gia tăngvấn đề có liên quan đến bệnh do vi khuẩn [20]

Nhóm vi khuẩn vibrio, một trong những tác nhân gây bệnh chủ yếu đốivới động vật thủy sản Bệnh do vi khuẩn vibrio đã được phát hiện rất sớm từnăm 1970 bởi Tukiash Đến năm 1977, Fisher đã phát hiện ra vi khuẩn vibriogây bệnh trên các loài tôm hùm châu Mỹ, châu Á Kết quả này cũng được côngbố bởi Roald và Bowser, 1981 Năm 1996, Lightner phát hiện các loài tôm he

(Penaeus spp), tôm thẻ (Metapenaeus spp) cũng bị nhiễm vibrio Năm 1990,

Hassawai cho rằng phẩy khuẩn đã gây bệnh đỏ thân ở Thái Lan Hầu như tất cảcác loài động vật thủy sản nuôi nước lợ mặn đều có thể nhiễm và chịu tác hại củabệnh vibrio.[20]

Các nghiên cứu cho thấy việc giảm sút sản lượng tôm nuôi liên quan đếnbệnh vi khuẩn thường do chính nhóm vi khuẩn phát sáng gây ra (Ruangpan,

1987) Vấn đề này dường như khá phổ biến ở các nước châu Á nơi mà việc nuôitôm được xem như hoạt động chính yếu trong sinh kế của người dân Bệnh donhóm vi khuẩn phát sáng đã gây thiệt hại kinh tế trong nuôi tôm công nghiệp ởPhilippines (Fernandez và Mayo, 1994), Ấn Độ (Raju, 1994) và Indonesia(Sulasmi, 1994; Taslihan và Wijayati, 1994) [20]

Kết quả từ việc điều tra vi khuẩn phát sáng vùng duyên hải ở Thái Lancho thấy vi khuẩn phát sáng là một trong những thành phần loài trong khu hệ vikhuẩn ở vùng cửa sông, vùng nước lợ (Sodthongkong, 1996) Điều này đượcchứng minh từ kết quả phân lập vi khuẩn từ các mẫu nước cấp vào, thải ra cũngnhư các mẫu bùn trong hệ thống ao nuôi tôm có nguồn nước cấp từ vùng duyênhải (Sae-Oui, 1987; Songsrem, 1990; Ruangpan, 1997) Chất thải từ hệ thốngtiêu hóa, trứng của tôm mẹ được nghi ngờ có chứa vi khuẩn phát sáng (Shariff vàSubasinghe, 1992) [20]

Từ mẫu bệnh phát sáng của ấu trùng, hậu ấu trùng, các tác gia đã phân lậpđược những loại khác nhau của giống vibrio Ở Philippin, C.L.Pilogo, M.C.L

Baticados, E.R.Crus và L.de Lapena đã phân lập được hai loài: Vibrio harveyi và

Vibrio splendidus Trong khi đó ở Thái Lan, người ta lại tìm thấy Vibrioparahaemolyticus.[22]

Trước đây, nhóm vibrio được xem như nhóm vi khuẩn cơ hội (Lightner,1988) Tuy nhiên gần đây qua nhiều ổ dịch xảy ra trên tôm sú nuôi do vi khuẩnvibrio gây ra cho thấy loài này đóng vai trò gây bệnh tiên phát thật sự chứ khôngphải vi khuẩn cơ hội (Lightner, 1992) Vibrio gây chết ấu trùng tôm, tôm giống,tôm thương phẩm, kể cả tôm trưởng thành Dịch bệnh có thể gây chết 100%(Lightner, 1983).[22]

Năm 1985, lần đầu tiên phát hiện bệnh hoại tử gan ở tôm he tại vùngTaxas, sau đó dịch bệnh được tìm thấy ở Peru, Ecuador, Venezuala, Pacma,Costarica Năm 1996, D.Lighter đã nghiên cứu tìm thấy tác nhân gây bệnh hoạitử gan ở tôm he nuôi được xác định là một giống vi khuẩn thuộc lớpProteobacteri Đây là một dạng vi khuẩn gram (-), đa dạng, sống ký sinh trongnội bào.[4]

Các kỹ thuật chẩn đoán trước đây chủ yếu dựa vào phương pháp phân lậpvi khuẩn kết hợp với các triệu chứng bệnh tích cũng như mô bệnh học Hiện naycó thể dùng kỹ thuật khuếch đại ADN để chẩn đoán nhanh bệnh do vi khuẩntrong vài giờ mà không phải mất nhiều thời gian để phân lập vi khuẩn(Dalsgaard, 1996).[19]

2.2.2 Tại Việt Nam

Ở Việt Nam, bệnh thuỷ sản được nghiên cứu chậm hơn so với các nướctrên thế giới Việc nghiên cứu bệnh thuỷ sản ở nước ta bắt đầu từ những năm củathập niên 60 và ngày càng được chú trọng Lúc này, nghề nuôi tôm đã bắt đầuphát triển tại Việt Nam Năm 1985, các nhà khoa học, các chuyên gia về thuỷsản bắt đầu nghiên cứu đi sâu vào lĩnh vực bệnh tôm, tuy còn non trẻ, nhưng donhu cầu của thực tiễn, nên chỉ trong một thời gian ngắn hàng loạt công trình lớnđã được áp dụng rộng rãi vào sản xuất, đem lại hiệu quả cao.

Từ những năm 1989-1990, các nhà nghiên cứu đã phát hiện rằng: bệnhvibrio, đặt biệt bệnh phát sáng rất phổ biến trong các trại sản xuất tôm sú giống,trong ao nuôi thương phẩm ở Việt Nam, có thể gặp bất kỳ một cơ sở sản xuấtnào (Đỗ Thị Hòa, 1995-1997).[4], [8]

Năm 1991, Nguyễn Trọng Nho cùng cộng sự khi nghiên cứu một số bệnhtrên tôm sú ở Khánh Hoà đã thông báo một số dấu hiệu bệnh lý trên tôm sú nuôi.

Đỗ Thị Hoà năm 1994, với đề tài nghiên cứu một số bệnh do tác nhân vikhuẩn, nấm nguyên sinh, động vật và giun tròn Trong đó một số bệnh gây táchại lớn được tác giả cho biết đó là: bệnh phát sáng, bệnh đỏ dọc thân trên tôm sú,bệnh mềm vỏ, bệnh do động vật đơn bào.

Năm 1994, khi dịch bệnh tôm gây chết hàng loạt ở đồng bằng sông CửuLong Nguyễn Việt Thắng và cộng tác viên đã nghiên cứu đề tài “Tìm hiểunguyên nhân tôm chết ở đồng bằng sông Cửu Long” Theo kết quả nghiên cứucủa Nguyễn Việt Thắng cho thấy vi khuẩn hiện diện khá cao trên tổng số mẫuthu xét nghiệm, nhiều loại Vibrio xuất hiện với tần số lớn, 2/3 xã điều tra chothấy hiện tượng nhiễm khuẩn (Pycnozec nhân) chiếm tỷ lệ 80-100%, điều nàycho thấy các mô hình nuôi quảng canh, đặc biệt mô hình nuôi tôm sú trên ruộng

lúa Bên cạnh tác nhân virus, vi khuẩn cũng là một tác nhân khá nguy hại kháccho tôm nuôi nếu đàn tôm bị nhiễm khuẩn với cường độ cao, số lượng lớn [20]

Năm 1996, Đỗ Thị Hoà cùng cộng sự đi sâu vào nghiên cứu các tác nhângây bệnh trên tôm sú ở khu vực Nam Trung Bộ phát hiện vi khuẩn cảm nhiễmtrên tôm, kết quả này mở ra nhiều triển vọng cho nghề nuôi tôm tại Việt Nam.

Năm 1997, Đỗ Thị Hòa nghiên cứu và phát hiện ra vi khuẩn vibrio tồn tạirất phổ biến ở nước biển ven bờ, mật độ vibrio trong nước biển ven bờ có thểtăng lên nhiều lần vào các ngày biển động do bão, gió mùa hay áp thấp nhiệt đới.

Năm 2002, Đỗ Thị Hòa thông báo các loài tôm hùm châu Mỹ: Homarus

americarus, H.gammarus và tôm hùm châu Á: Panulirus hormarus,P.ornatus, đều bị cảm nhiễm vibrio.[4], [8]

Ở Việt Nam, đã tìm thấy loại vi khuẩn dạng sợi bám, gây bệnh cho tômnuôi khu vực miền Trung, đặc biệt trong các bể ấp ấu trùng, trong các ao nuôithâm canh.[4]

Kết quả điều tra bước đầu về dịch tễ học của bệnh hoại tử gan tại vùngnuôi tôm thịt tỉnh Khánh Hòa cho thấy bệnh xảy ra từ tháng 2 cho đến hết chu kỳnuôi Bệnh phát triển vào mùa khô, mùa có nhiệt độ cao (28 - 350C), độ mặn cao(30 - 40%).[4]

Theo phân lập của Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản I, đã phân lậpđược cầu khuẩn gram dương, trực khuẩn dung huyết mạnh, gram âm từ mẫu tômbị bệnh đục thân ở Hải Phòng.[22]

Gần đây công trình nghiên cứu lớn là đề tài cấp nhà nước mang mã số :KN -04-12 do Hà Ký đã nghiên cứu được 13 loại bệnh vi khuẩn tôm Ông đãcông bố đầy đủ các khâu từ phân lập vi khuẩn, tác nhân gây bệnh, dấu hiệu bệnhlý, phân bố và lan truyền, biện pháp phòng trị với một số bệnh được đi sâunghiên cứu như: bệnh phát sáng ở ấu trùng tôm sú, bệnh đỏ dọc thân ở ấu trùngtôm sú, bệnh hoại tử đốm nâu ở tôm càng xanh.[5]

2.3 Tình hình sử dụng hợp chất chiết xuất từ thảo dược

2.3.1 Trên thế giới

Việc tăng năng suất, sản lượng Nuôi trồng thủy sản bằng cách ồ ạt pháttriển nghề nuôi tôm khiến dịch bệnh ngày càng trở thành một vấn đề gây nhứcnhối cho người nuôi Để xử lý vấn đề này, các loại hoá chất, kháng sinh đượcxem như biện pháp đầu tiên được con người sử dụng để điều trị cho các loại thuỷsản Tuy nhiên, việc sử dụng các loại hoá chất, kháng sinh không đúng quy cách,liều lượng đang gây ảnh hưởng lớn tới sinh thái môi trường Bên cạnh đó, việctồn dư kháng sinh còn ảnh hưởng rất lớn tới sức khoẻ của con người Trongnhững năm gần đây, xu hướng sử dụng thảo dược trong điều trị cho bệnh thuỷsản đang được sử dụng rộng rãi trong việc điều trị bệnh trên động vật thuỷ sản.Hơn nữa việc sử dụng thảo dược có biên độ an toàn lớn, ít ảnh hưởng tới môitrường sinh thái cũng như môi trường nuôi, đồng thời không ảnh hưởng tới sứckhỏe của con người [15] Các chiết xuất từ thảo dược như hinokiticol, citral,allylisocyanate được sử dụng rộng rãi trong bảo quản, điều trị bệnh do nấm, vikhuẩn gây ra [15]

Năm 1858, nhà bác học Pháp Louis Pasteur đã chứng minh được côngdụng diệt vi khuẩn của tỏi Năm 1944, nhà hóa học Chester J Cavallito đã phântích được hợp chất allicin trong tỏi có công dụng như thuốc kháng sinh Allicinchỉ có trong tỏi chưa nấu hay chế hóa Kháng sinh này mạnh bằng 1/5 thuốcpenicillin, 1/10 thuốc tetraciline, có tác dụng trên nhiều loại vi khuẩn, xua đuổihoặc tiêu diệt nhiều sâu bọ, ký sinh trùng, nấm độc Năm 1948, Marchado cùngcộng sự đã chiết suất từ tỏi được garcilin, chất này không có mùi lưu huỳnh,không độc, ứng dụng tốt trong bệnh nhiễm trùng Shigella, Salmonella hoặc cácbệnh ký sinh trùng như giun kim, giun đũa, giun tóc Một nghiên cứu khác tạiBrazil năm 1982 đã chứng minh nước tinh chất của tỏi có thể chữa được nhiềubệnh nhiễm độc bao tử, do thức ăn có lẫn vi khuẩn

Năm 1880, Davaine đã bắt đầu nghiên cứu tính kháng khuẩn của lá hồ đào

đối với Bacillus anthracis R.Koch (1887) nghiên cứu chứng minh tính kháng

khuẩn của nhiều loại tinh dầu Cũng trong thời gian này Chamberland chứngminh nhiều loại tinh dầu có tính kháng khuẩn, các thí nghiệm này được nhiều

người như: Cadeae, Mennic, Bering, Reilling, tiếp tục nghiên cứu Năm 1959,

Horak và Santavi chiết xuất từ cannabit sativa - Cannabinnacea, được chất

cannabiriolic, dung dịch 10 - 15µg/ml có tác dụng diệt khuẩn với vi khuẩn gâybệnh lao ở người, vi khuẩn Gram (+), đặc biệt vi khuẩn kháng lại penicillin.[15], [20]

Một nghiên cứu khác của Tokin (1928) đã chứng minh nhiều chất bay hơitừ cây xanh như Phytocid có tác dụng với vi khuẩn, nhiều công trình nghiên cứuđã xác nhận rằng các chất kháng khuẩn có nguồn gốc từ thực vật rất phong phú,có phạm vi ứng dụng rất rộng rãi [21 ]

Từ củ của cây stephania cepharantha - Menispermaceae Năm 1934Kondo và cộng sự tách chiết một alcaloid có tên cepharantin, chất này có tácdụng với vi khuẩn lao ở nồng độ 10 - 20mg/ml Năm 1944 Gupta và Kahali đãchiết suất từ cây berberis vulgaris chất berberin, chất này có ảnh hưởng tốt đối

với các bệnh ký sinh trùng do Leishmannia tropica, Trypanosoma equiperdum

gây ra Theo Schlederer (1962) có thể tiêm dung dịch berberin 2% trị khỏi bệnhbouton d’orient Ukita Mizuno và Tamura (1949) nhận thấy berberin có tác dụng

tốt hơn sunfathiazon đối với Staphylococcus auraus, Shigella, Gonococcus [15]

Năm 1985, Khuê Lập Trung đã đưa ra 22 loài thảo dược, chủ yếu phòngtrị các bệnh về vi khuẩn, ngoại ký sinh trùng, bệnh đường ruột cho tôm, cá vànhuyễn thể như: Xuyên tâm liên, địa niên thảo, lưu xổ tử, quản trọng, ngủ bội tử,tiền thảo, [14] [15]

Tại Thái Lan, Sataporn Direkbusarakom và cộng sự (1997) đã thử nghiệm

thành công khả năng kháng khuẩn của các loài thảo dược như: O.sanctum,

C.alata, Tinospora cordifolia, Eclipa alba, Tinospora cripspa, Psidium guajava,Clinacanthus nutans, Andrographic panniculata, Momordica charatina,Phyllanthus reticulates, P pulcher, P acidus, P debelis, P amarus, P debelis

và P urinaria đối với vi khuẩn Vibrio spp Tuy nhiên, chỉ có hai cây P.guajavavà M.charantina có hiệu quả ức chế đối với Vibrio spp Nồng độ ức chế tối thiểucủa P guajava là 0,625 mg/ml và M charantina là 1,25 mg/ml [15]

Gần đây, Trung Quốc đã chiết tách được một loại Ankanoid từ cây xoanrừng có tên Yanatren hoặc sử dụng hạt với tên kosam, enkosam có tác dụng điềutrị lỵ amip [20]

Các kết quả trên chỉ mới bước đầu thử nghiệm sàng lọc các loại thảodược chưa xác định được thành phần nào trong thực vật có tác dụng trên virus vàvi khuẩn.

2.3.2 Tại Việt Nam

Từ xa xưa, dân ta đã biết dùng những cây cỏ quen thuộc trong vườn nhàđể trị các bệnh thông thường như một số bệnh đường ruột, bệnh đường hô hấp,tiết niệu, trị mụn nhọt, rửa vết thương, [2], [3], [6]

Theo y học cổ truyền, phần lớn những cây thuốc có tác dụng chữa bệnhnhiễm khuẩn đã được xếp trong nhóm thuốc thanh nhiệt giải độc, thanh nhiệt,táo thấp, thuốc khử hàn, như alicin trong tỏi, odorin trong hẹ, [2], [6]

Từ thế kỷ XIV, Đại y thiền sư Tuệ Tĩnh đã sử dụng nhiều thảo mộc nhưtỏi , hẹ , tô mộc, hạt cải, trầu không để trị một số bệnh viêm nhiễm [6]

Từ giữa thế kỉ XX, theo kết quả nghiên cứu của Phạm Văn Ngữ (1956)trên 500 loài cây thuốc, đã khẳng định rằng nhiều cây có tác dụng kháng khuẩnrất lớn Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Văn Hưởng và cộng sự (1959),trên 1000 cây thuốc, chỉ ra rằng kháng sinh thực vật sử dụng rất an toàn, có tácdụng mạnh, nhóm nghiên cứu đã đưa ra chế phẩm cây tô mộc trị bệnh tiêu chảy

Ở Miền Bắc, Hà Ký (1995) và cộng sự trong chương trình KN 04 - 12 đãnghiên cứu một số loài thảo dược dùng để phòng trị bệnh trên cá Bước đầu đã

chọn được 9 loài cây thuốc sau: Rau nghể (Polygonum hydropiper), rau sam(Portulaca cleracea), cây cỏ sữa lá to (Euphorbia hirta), cỏ sữa lá nhỏ(Euphorbia thymifolis), sài đất (Wedelia calendu lacae), nhọ nồi (Eclipta alba),bồ công anh (Lactuca indica), cây vòi voi (Heliotropium indicum), cây chó đẻrăng cưa (Phyllanthus urinaria) có thể sử dụng trong phòng trị bệnh trên động

vật thuỷ sản [14]

Ở miền Nam, các cây cỏ được dùng trong phòng trị bệnh cho vật nuôithuỷ sản chủ yếu từ kinh nghiệm dân gian người dân đã biết dùng cây cỏ mực

(Eclipta alba), cây trầu (Piper betel) để trị bệnh kí sinh trùng cho động vật thuỷ

sản, một số địa phương khác theo kinh nghiệm người dân cũng biết dùng một sốloài thực vật quen thuộc để chữa bệnh cho tôm cá đem lại hiệu quả như ở Nghệ

An, Huế Ngoài ra một số địa phương dùng cây tỏi (Allium sativum) để phòng,

trị bệnh cho động vật thủy sản [14], [15]

Bùi Quang Tề, Lê Xuân Thành và cộng tác viên đã nghiên cứu thành cônghai loại chế phẩm thảo dược VTS1-C, VTS1-T phối chế từ các hoạt chất chiết

tách từ tỏi (Allium sativum), sài đất (Weledia calendulacea) sử dụng phòng bệnh

cho tôm cá, kết quả cho thấy tỏi, sài đất đều có tác dụng với cả 6 loài vi khuẩn:

Vibrio parahaemolyticus, V.harveyi, V.alginolyticus, Aeromonas hydrophyla,Edwardsiella tarda và Hafnia alvei gây bệnh ở nước ngọt, nước lợ mặn.

Từ năm 2000, Nguyễn Ngọc Hạnh và cộng sự đã nghiên cứu thử nghiệmthành công các hợp chất chiết xuất từ thảo dược, như hepato và alixin có tácdụng hỗ trợ tiêu hoá tốt, giúp tôm khoẻ mạnh, sinh trưởng bình thường, có khảnăng chống nhiễm bệnh đặc biệt các bệnh về gan Trong đó hepato có công dụnghỗ trợ và bảo vệ gan phòng và trị bệnh về gan như MBV và teo gan [15]

Nghiên cứu khác của Phan Xuân Thanh (năm 2002) đã xác định được chất2-hydroxy-6-pentandecatrienilbenzoat có nguồn gốc từ thảo dược, có tác dụngphòng trừ các bệnh do vi khuẩn và nấm gây ra Nhằm mục đích sử dụng các hoạtchất sinh học thay thế các hoá chất độc hại, kháng sinh bị cấm sử dụng trong lĩnhvực nuôi trồng thuỷ sản [19]

Gần đây khi nghiên cứu khả năng kháng nấm của dịch chiết lá trầu,Nguyễn Ngọc Phước và cộng sự (2006) kết luận chiết xuất từ lá trầu có khả năng

tiêu diệt các loài nấm thuộc họ Lagenladium, chủng nấm này gây bệnh phổ biến

trên tôm nước lợ, mặn Dịch chiết lá trầu có khả năng ức chế, tiêu diệt các loại vi

khuẩn Aeromonas hydrophyla và Vibrio sp.

Năm 2008, Nguyễn Anh Tuấn đã nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của

dịch chiết tỏi và lá húng đối với vi khuẩn Areomonas gây bệnh đốm đỏ ở cá

Trắm Cỏ tại Thừa Thiên Huế.

2.4 Một số thảo dược sử dụng trong nuôi trồng thủy sản

2.3.1 Cây thuốc cá (Derris spp)

Dùng cây thuốc cá để diệt cá tạp trong ao, đầm nuôi tôm: lấy rễ cây đậpgiập nát để ra chất nhựa trắng, sau đó đem ngâm nước, lấy nước đó té đều xuốngao, hoặc ngâm xuống ao với liều lượng 3-5kg rễ tươi/1.000m2 ao ở mức nước15-20cm [2] ,[3], [6]

2.3.2 Cây xoan (Melia azedarach)

Dùng lá xoan để diệt trùng mỏ neo và trùng bánh cho cá rất tốt: lấy cànhlá xoan non bó thành bó ngâm trong lồng nuôi cá đang bị bệnh trùng mỏ neo,trùng bánh xe, hoặc ngâm trong cá nuôi ở phía đầu nguồn nước với lượng 150-200kg lá xoan/1.000m2 ao có mức nước 1,5 - 2m hoặc 20-25kg lá xoan/lồng cá8m2 [2] ,[3], [6]

2.3.3 Cây thàn mát (Milletia ichthyochtona)

Quả khi già hạt có chứa 30-40% dầu và chất gây độc (như rotenon, sapotoxin)đối với cá Có thể dùng hạt thàn mát để diệt cá tạp trong ao nuôi tôm.

Cách dùng: nghiền nát hạt rồi hoà vào nước, dùng nước đó tưới đều lên ao;hoặc đập nát cho vào bao tải ngâm ở ao, tác dụng chậm hơn Liều lượng cứ 0,5-1kg hạt dùng cho một ao 1.000 m2 ở mức nước 15 -20 cm [2] ,[3], [6]

2.3.4 Cây sở (Cammellia sasanqua)

Sở là cây ép lấy dầu, bã làm thành bánh (khô dầu sở) có chứa chấtsaponozit gây độc làm chết cá và có tác dụng diệt khuẩn Khô dầu sở có tác dụngđể cải tạo ao đầm nuôi tôm Khi dùng, cần nghiền nát khô dầu sở rồi rải xuốngao, hay ngâm trong nước [2] ,[3], [6]

2.3.5 Cây bồ hòn (Sapindus mukorossi)

Quả bồ hòn có nhân, hạt rất độc Người nuôi cá, tôm dùng hạt để diệt cá tạp khi cải tạo ao đầm Khi dùng, giã hạt thật nhỏ, hoà tan với nước, dùng nước này té đều khắp ao với liều lượng 0,5-1kg hạt/1.000 m2 ao có mức nước 15-20cm [2] ,[3], [6]

2.3.6 Cây thầu dầu tía (Ricinus communis L.)

Lá thầu dầu có chất đắng, dùng để chữa bệnh loét mang, đốm đỏ cho cá rấthiệu quả: Lấy lá thầu dầu bó thành từng bó ngâm xuống ao với lượng 250-300kg láthầu dầu/ha ao, với mức nước sâu 1,5 – 2 m [2] ,[3], [6]

2.3.7 Cây nghể (Polygonum hydropipe L.)

Nghể là cây có vị cay nóng, hắc Dùng cây này chữa bệnh viêm ruột, loétmang cho cá trắm cỏ, rô phi, có hiệu quả nhất đối với cá giống: Lấy thân cây và lábăm nhỏ, nấu kỹ lấy nước, sau đó trộn với thức ăn cho cá ăn, với liều lượng 3 kgthân lá nghể tươi/100 kg cá giống, cho cá ăn liên tục từ 3 - 6 ngày Cũng có thểdùng lá nghể khô xay thành bột trộn với thức ăn cho cá, 1 – 2 kg nghể khô/100 kgcá giống [2] ,[3], [6]

2.3.8 Cây rau sam (Portulacaoler acea L.)

Dùng rau sam để chữa bệnh viêm ruột do vi khuẩn đối với cá trắm cỏ Khidùng, rửa sạch rau rồi vô trùng bằng nước muối 3%, rải rau trong khung nổi ở aohoặc trong lồng cá, mỗi ngày cho ăn một lần, liên tục trong 6 ngày với liều lượng1,5-3kg rau sam/100kg cá Đối với cá giống cần băm nhỏ rau, rắc đều trên mặt aohoặc trong lồng cá [2] ,[3], [6]

2.3.9 Cây tía đỏ ( Ricinus communis L.)

Cây tía đỏ thường được dùng để chữa bệnh đường ruột cho động vật thuỷsản Khi dùng lấy thân và lá cây băm nhỏ, nấu kỹ, lấy nước trộn với thức ăn tinh rồicho ăn lượng 0,2 - 0,5 kg lá/kg thức ăn, cho ăn liên tục trong 3 - 5 ngày [2] ,[3], [6]

2.3.10 Tỏi (Allium sativum L.)

Tỏi được dùng chữa bệnh đường ruột cho cá nuôi Khi dùng cần nghiền nátcủ tỏi, trộn lẫn với thức ăn tinh cho cá ăn, liều lượng 0,5 - 1,5 kg tỏi, trộn với thứcăn/100 kg cá, cho cá ăn liên tục 6 ngày [2] ,[3], [6]

2.3.11 Cây cau (Areca catechu)

Chất arecolin trong hạt cau có tác dụng oxy hoá protein của tế bào kí sinhtrùng làm tê liệt thần kinh của giun sán, làm tê liệt cả cơ trơn làm giun sán khôngbám vào thành ruột được nên dễ bị đẩy ra ngoài Dùng hạt cau với liều lượng 4g hạtcau/1kg cá/1 ngày, cho ăn trong 3 ngày để trị giun tròn kí sinh trong ruột cá trê

(Spinitectus clariasi) [2] ,[3], [6]

Hình 3.1 Tôm thẻ chân trắng

PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian nghiên cứu: 1/2008 – 5/2009

- Địa điểm: Phòng thí nghiệm khoa Thủy sản – Trường Đại học Nông Lâm Huế.- Địa điểm thu mẫu: Xã Quảng An, huyện Quảng Điền, tỉnh Thừa Thiên Huế

3.2 Đối tượng nghiên cứu

3.2.1 Tôm Thẻ Chân Trắng Penaeus Vannamei

Phân loại:

Ngành: Arthropoda Lớp: Crustacea Bộ: Decapoda

Họ chung: Penaeidea

Họ: Penaeus Fabricius Giống: Penaeus

Loài: Penaeus vannamei

Hình 3.3 Lá húngHình 3.2 Tỏi

3.2.2 Các loại thảo dược

- Tỏi (Allium sativum L.).

Thành phần kháng thuốc chủ yếu làchất alicin (C6H10OS2) có khả năng diệtkhuẩn mạnh, ở động vật thủy sản nó có tácdụng rất tốt với các vi khuẩn gam (-) Trongtỏi tươi không có chất alicin, nó chỉ đượchình thành khi tỏi đã được phơi khô Trongtỏi tươi có chứa aliin dưới tác dụng alinasecó trong tỏi để tạo thành alicin.[6]

- Lá húng (Ocimum basilicum L).

Rau húng là cây thân thảo, thân nhẵnhoặc có lông, thường phân cành ngay từ dướigốc Cây cao 50-60 cm Lá mọc đối, cócuống, phiến lá hình thuôn dài Có loại màuxám lục, có loại màu tím đen nhạt.

Hoa nhỏ màu trắng hay hơi tía, mọcthành chùm đơn hay phân nhánh, với nhữnghoa mọc thành vòng, 5-6 hoa một vòng.

Thành phần hoá học: Lá chứa nhiều hợp chất flavonoid (heterosid củaflavon), triterpen, carotenoid Tinh dầu chiếm đến 1-3% trọng lượng khô Tinhdầu có thành phần chính: Eugenol (70%), methyleugenol (12%), beta-caryophyllen Cácthành phần chính: Menthol (30-50%), menthon (20-35%), acetat menthyl (4-10%) Thành phần tinh dầu thay đổi tuỳ theo nhiều yếu tố: Di truyền, thời vụtrồng, cách trồng, điều kiện khí hậu.[6]

- Cây rau má (Centell asiatica).

Rau má có tên khoa học là Centella asiatica (L.) thuộc họ hoa tán

umbelliferae Rau má còn có tên là tích tuyết thảo Loại thực vật nầy mọc lantrên mặt đất có lá trông giống như những đồng tiền tròn được xếp nối tiếp nhaunên còn gọi là liên tiền thảo Là một thứ rau dại ăn được thường mọc ở những

Hình 3.5 Cây diếp cá

nơi ẩm ướt như thung lủng, bờ mương thuộcnhững vùng nhiệt đới như Việt nam, Lào,Cambuchia, Indonesia, Malasia, Srilanka, Ấnđộ, Pakistan, Madagascar Cây rau má cóthân nhẳn , mọc lan trên mặt đất, có rể ở cácmấu Lá có cuống dài mọc ra từ gốc hoặc từcác mấu Lá hơi tròn, có mép khía tai bèo.Phiến lá có gân dạng lưới hình chân vịt Hoamọc ở kẻ lá Cánh hoa màu đỏ hoặc tía.

Tuỳ theo khu vực trồng hoặc mùa thu hoạch tỷ lệ các các hoạt chất có thểsai biệt Thành phần của rau má bao gồm những chất sau: Beta caroten, sterols,saponins, alkaloids, flavonols, saccharids, calcium, iron, magnesium, manganese,phosphorus, potassium, zinc, các loại vitamins B1, B2, B3, C và K.[6]

- Cây diếp cá (Houttuynia cordata).

Cây diếp cá còn có tên là cây giấp cá, dấp cá Tên khoa học là Houttuynia

cordata Họ lá giấp Saururaceae Tên tiếng Anh của nó là heartleaf (lá hình tim)hay lizardtail (đuôi thằn lằn).

Diếp cá có nguồn gốc ở Nhật Bản,miền nam Trung Quốc và Đông Nam Á, làmột loại cỏ nhỏ, mọc lâu năm, ưa chỗ ẩmướt, có thân rễ mọc ngầm dưới đất Rễ nhỏmọc ở các đốt, thân mọc đứng cao 40 cm,có lông hoặc ít lông Lá mọc cách, hình tim,đầu lá hơi nhọn hay nhọn hẳn Hoa nhỏ,không có bao hoa, mọc thành bông, có 4 lábắc màu trắng; trông toàn bộ bề ngoài củacụm hoa và lá giống như một cây hoa đơnđộc Toàn cây vò có mùi tanh như mùi cá.[6]

Hình 3.4 Cây rau má

Theo Đỗ Tất Lợi, trong cây có chừng 0,0049% tinh dầu và một ít chấtancaloit gọi là cocdalin Thành phần chủ yếu của tinh dầu là metylnonylxeton,chất myrcen, axit caprinic và laurinaldehyt Hoa và quả chứa chất isoquexitrin vàkhông chứa quexitrin Độ tro trung bình là 11,4%, tro không tan trong HCl là2,7%.

3.3 Nội dung nghiên cứu

Phân lập, định danh vi khuẩn gây bệnh ở tôm thẻ chân trắng.

Thử nghiệm tác dụng của các thảo dược lên chủng vi khuẩn phân lập được.So sánh khả năng kháng khuẩn của các loại thảo dược.

3.4 Dụng cụ - Hoá chất - Môi trường

3.4.1 Dụng cụ thí nghiệm

Tủ ấm để nuôi cấy vi khuẩn

Kính hiển vi có vật kính: 10x, 20x, 40x, 100x.Que cấy, bộ giải phẫu: Kéo, dao, panh, kim tiêm.Hộp lồng, ống nghiệm, pipets, lam, lamen, đèn cồn.Bông lau, băng dính, bông không thấm nước.

Dầu soi kính, nước muối sinh lí 0,9%, nước cất vô trùng.

3.4.2 Môi trường , hoá chất

Môi trường phân lập vi khuẩn từ mẫu bệnh phẩm: môi trường chọn lọcTCBS (Thiosulphate Citrate Bilesalt sucrose).

Môi trường nuôi cấy tăng sinh: Pepton Môi trường nuôi cấy chuyên biệt: TCBSCác môi trường dùng cho phản ứng sinh hoá:

+ Môi trường cơ bản O/F.

+ Môi trường KIA (Kligler Iron Agar)

+ Môi trường đường các loại (Glucose, sucrose, mantose, manitol)

+ Môi trường Simon Citrate Agar.+ Môi trường khử Nitrate.

+ Môi trường MR-PV Broth.

+ Môi trường Tryptophan Broth Agar.+ Môi trường Tryptone.

Một số thuốc thử và thuốc nhuộm cần thiết:

+ Dung dịch Kovac’S dùng cho phản ứng Indol.

+ Thuốc thử Methyl Red, dùng cho phản ứng Methyl Red.+ Thuốc thử dùng cho phản ứng V-P:

 Dung dịch KOH 20%

 Dung dịch Alphanapthol 10%.+ Thuốc thử cho dung dịch Nitrate:

 Dung dịch Naphthylamine. Dung dịch Acid Sunlfamilic.+ Thuốc dùng cho nhuộm Gram:

 Dung dịch tím Gentian hay tím Crystal. Dung dịch Lugol.

 Dung dịch Cồn-Aceton hay cồn-Acid. Dung dịch Fuchsin hoặc Safranin.+ Dung dịch rửa dụng cụ thủy tinh.

 Dung dịch Sulfua Cromic. Dung dịch KOH trong cồn.

3.5 Phương pháp nghiên cứu

3.5.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát

3.5.2 Phương pháp thu mẫu

Tôm có biểu hiện bất thường, được thu nguyên con, còn sống hoặc mới

chết Tôm được đo chiều dài, cân trọng lượng khi lấy mẫu phân lập Mẫu bệnh

phẩm đem nuôi cấy lấy từ các cơ quan có dấu hiệu bị bệnh.

Mẫu bệnh phẩm

Quan sát dấu hiệu bệnh lýĐo chiều dài, trọng lượngCơ quan có dấu hiệu bệnh lý

Nuôi cấy trong môi trường TCBS

Chọn khuẩn lạc ưu thếNuôi cấy thuần trên môi trường TCBS

Định danh vi khuẩn

Nuôi cấy tăng sinh trong môi trường pepton lỏngXác đinh nồng độ (106)

Thử nghiệm dịch chiết các loại thảo dược ở nồng độ khác nhau

Sơ đồ 3.1: Sơ đồ nghiên cứu tổng quát

Hình 3.6 Cân trọng lượng, đo chiều dài tôm bị bệnh

pháp nuôi cấy phân lập, định danh vi khuẩn

Phương pháp phân lập xác định vi khuẩn gây bệnh dựa trên phương phápnghiên cứu của Bergey (1957) và Nguyễn Lân Dũng (2006).

3.5.3.1 Nuôi cấy phân lập

Lấy mẫu bệnh phẩm: Cơ, mang, chân bơi, gan tụy của mẫu tôm đượcphân nhỏ, nghiền trong ống nghiệm chứa 2ml dung dịch nước muối sinh lý.Dùng que cấy vô trùng, lấy bệnh phẩm vạch trên đĩa thạch TCBS một số đườngđể được vùng 1 Hơ nóng đỏ que cấy trên ngọn lửa đèn cồn Để nguội bằng cáchấn dần que cấy vào mép đĩa thạch Đặt que cấy lên đĩa thạch tại vùng 1, vạchmột số đường liên tiếp để được vùng 2 Tiếp tục như vậy ta được vùng 3.

Lật ngược đĩa lồng, nuôi cấy ở nhiệt độ 30-370C, trong 24 giờ.

Sau 24 giờ, kiểm tra sự phát triển của các khuẩn lạc Dựa vào màu sắc,hình dạng, kích thướt khuẩn lạc để phân biệt các loại khuẩn lạc có trên đĩa lồng,từ đó chọn ra khuẩn lạc nghi ngờ Khuẩn lạc nghi ngờ là khuẩn lạc chiếm ưu thếtrên đĩa phân lập.

3.5.3.2 Nuôi cấy thuần chủng

Mở đĩa các khuẩn lạc nghi ngờ (dưới ngọn đèn cồn).

Dùng que cấy vô trùng, lấy bệnh phẩm từ một khuẩn lạc nghi ngờ riêng rẽ.Cấy lên đĩa thạch mới, để ở nhiệt độ 30-370C, trong 24h sẽ có một đĩalồng chứa vi khuẩn thuần chủng.

3.5.3.3 Phương pháp nhuộm vi khuẩn

Dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn từ khuẩn lạc Dùng que cấy phết, dànmột lớp mỏng trên tấm lam sạch Để mẫu tự khô ở nhiệt độ phòng, sau đó hơ caotấm lam trên ngọn lửa đèn cồn.

Nhuộm Gram theo các bước sau:

+ Nhỏ dung dịch tím Crystal lên mẫu để 30 - 60 giây.+ Rửa nhanh bằng nước, rảy khô nước.

+ Nhỏ dung dịch Lugol lên mẫu để 1 phút + Rửa nhanh rảy khô nước.

+ Nghiêng lam kính, nhỏ cồn 96% lên tẩy màu.+ Rửa nhanh bằng nước, rảy khô nước.

+ Nhỏ dung dịch Fuchsin lên mẫu, để 1 - 2 phút.

Rửa nước, rảy khô nước, có thể dùng khăn giấy thấm làm khô tiêu bản nhưngkhông để xước mẫu Nhỏ dầu lên tiêu bản, đem soi dưới kính hiển vi (vật kínhdầu) Nếu mẫu giữ nguyên màu xanh tím là vi khuẩn Gram dương, nếu mẫuchuyển màu hồng là vi khuẩn Gram.

3.5.3.4 Phương pháp thử các phản ứng sinh hóa- Thử phản ứng trên môi trường KIA.

Dùng que cấy thẳng vô trùng lấy vi khuẩn nghiên cứu ria một đường thẳng ởphần thạch nghiêng.

Sau đó cắm thẳng que cấy xuống phần thạch đứng (không chạm đáy).Nuôi cấy ở nhiệt độ 30 - 370C, trong 24 giờ rồi đọc kết quả.

Đọc khả năng lên đường glucose: Nếu (+), phần thạch đứng chuyển sang màuvàng Nếu âm tính (-), phần thạch đứng vẫn giữ màu vàng môi trường

Đọc khả năng lên men đường lactose: Nếu dương tính (+), phần thạch nghiêngchuyển màu vàng Nếu âm tính (-), phần thạch nghiêng không chuyển màu.