Đang tải... (xem toàn văn)
Bài viết trình bày việc xây dựng quy trình định lượng đồng phân quang học của rabeprazole bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với đầu dò MS/MS.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG PHÂN QUANG HỌC CỦA RABEPRAZOLE BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC VỚI ĐẦU DÒ MS/MS Trương Quốc Kỳ*, Nguyễn Thị Tường Vi**, Sang Seol Jeon***, Kyeong Ho Kim*** TÓM TẮT Mở đầu: Rabeprazole, - {[[4 - (3-methoxypropoxy) -3-methyl-2-pyri-dinyl] methyl] sulfinyl} -1Hbenzimidazole thuốc ức chế bơm proton phát triển để ức chế tiết axit dày H+/K+-ATPase Một tác nhân trị liệu mạnh sử dụng để điều trị số rối loạn tiêu hóa loét dày tá tràng Mục tiêu: Xây dựng quy trình định lượng đồng phân quang học rabeprazole phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) với đầu dò MS/MS Đối tượng - Phương pháp nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu phương pháp viên nén raperazole Các đồng phân quang học Rabeprazole định lượng kỹ thuật HPLC với đầu dò MS/MS Trong q trình thực nghiệm yếu tố ảnh hưởng đến hiệu tách độ chọn lọc phương pháp khảo sát tối ưu tốc độ dòng, nhiệt độ cột, cột phân tách đồng phân ((Chiralpak OD-H (250 x 4,6 mm i.d., μm), Chiralpak AD-H (150 x 4,6 mm i.d., μm), Chiralpak OJ-H (150 x 4,6 mm i.d., μm), Sumichiral OA-4900 (250 x 4,6 mm i.d., μm), Chirobiotic T (250 x 4,6 mm i.d., μm) and Chiralpak IC-3 (100 x 4,6 mm i.d., μm)), tỉ lệ pha động (mixture of n-hexane with ethanol, methanol or tetrahydrofuran, acetonitrile), chất thêm (diethylamine, n-butylamine, monoethanolamine ethylenediamine) nồng độ chúng Các thơng số đầu dò MS/MS khảo sát tối ưu Phương pháp thẩm định theo ICH Q2 (R1), 2005 Kết quả: Đã xây dựng quy trình định lượng đồng phân quang học rabeprazole với esomeprazole nội chuẩn Kết định lượng cho thấy quy trình có tính chọn lọc cao, có LOQ cho R-(+)-Rabeprazole S-(-)Rabeprazole 0,15 ng/ml, khoảng tuyến tính phương pháp khoảng nồng độ 0,15 - 100 ng/ml cho hai đồng phân Độ tỉ lệ phục hồi R-rabeprazole từ 89,18 – 101,68% từ 89,22 – 101,34% cho S-(-)Rabeprazole Đối với độ xác cho hai đồng phân R-(+)-Rabeprazole S-(-)-Rabeprazole 1,59% 1,58% Độ xác liên ngày (n=11) cho -(+)-Rabeprazole S-(-)-Rabeprazole 2,94% 3,04% Kết luận: Phương pháp LC-MS/MS để tách phần đồng quang học rabeprazole phát triển thẩm định Phương pháp có tính chọn lọc, nhanh chóng tin cậy cao việc phân tách đồng phân quang học rabeprazole Từ khóa: esomeprazole, rabeprazole, LC-MS/MS ABSTRACT QUANTITATIVE DETERMINATION OF ENANTIOMER OF RABEPRAZOLE BY HPLC WITH MS/MS DETECTOR Truong Quoc Ky, Nguyen Thi Tuong Vi, Sang Seol Jeon, Kyeong Ho Kim * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol 23 - No 3- 2019: 372-377 Background: Rabeprazole, 2-{[[4-(3-methoxypropoxy)-3-methyl-2-pyri-dinyl] methyl] sulfinyl}-1Hbenzimidazole is one of latest proton-pump inhibitors developed for suppression of gastric acid secretion by *Bộ mơn hóa chun ngành, Khoa Dược, Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch **Bộ mơn hóa phân tích, Khoa Dược, Đại học quốc tế Hồng Bàng ***Khoa Dược, Đại học quốc gia KangWon, Hàn Quốc Tác giả liên lạc: TS DS Trương Quốc Kỳ ĐT: 0936723672 Email: quockypharma7@gmail.com 372 Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học inhibition of the H+/K+-ATPase It is one of the most potent therapeutic agents used for treatment of several gastrointestinal disorders such as gastric and duodenal ulcers Objectives: The aim of a present research is to develop a liquid chromatography-electrospray ionizationmass spectrometry method for simultaneous separation of rabeprazole enantiomers Methods and subject: Various chiral column ((Chiralpak OD-H (250 x 4.6 mm i.d., μm), Chiralpak ADH (150 x 4.6 mm i.d., μm), Chiralpak OJ-H (150 x 4.6 mm i.d., μm), Sumichiral OA-4900 (250 x 4.6 mm i.d., μm), Chirobiotic T (250 x 4.6 mm i.d., μm) and Chiralpak IC-3 (100 x 4.6 mm i.d., μm)) were tried for optimum condition for HPLC system and various ratio of mobile phases (mixture of n-hexane with ethanol, methanol or tetrahydrofuran, acetonitrile), additives (diethylamine, n-butylamine, monoethanolamine and ethylenediamine) and its concentrations, flow rates and column temperatures ESI and APCI ion sources were tried for optimum condition for LC-MS/MS system and both electronic modes (positive and negative) were also tried The method was validated according to ICH Q2 (R1), 2005 Results: The method has been developed and validated for the identification of rabeprazole enantiomers using esomeprazole as the internal standard The method was validated over the concentration range of 0.15 – 100 ng/ml for both R-(+)- and S-(-)-rabeprazole The lower limit of quantification was 0.15 ng/ml for both enantiomers The intra-day precision varied 1.59% for R-rabeprazole and 1,58% for S-rabeprazole and the interday precision varied 2.94% for R-rabeprazole and 3.04% for S-rabeprazole The accuracy of R-rabeprazole ranged between 89.18 – 101.68% and S-rabeprazole ranged between 89.22 – 101.34% Conclusion: LC-MS/MS method for the separation of rabeprazole enantiomers was developed and validated Selective, rapid and reliable simultaneous chiral separation LC-MS/MS method for rabeprazole enantiomers Keyword: esomeprazole, rabeprazole, LC-MS/MS ĐẶT VẤN ĐỀ Rabeprazole, 2-{[[4-(3-methoxypropoxy)-3methyl-2-pyri-dinyl] methyl] sulfinyl}-1Hbenzimidazole thuốc ức chế bơm proton phát triển, có tác dụng ngăn tiết acid dày thông qua việc ức chế kênh H+/K+-ATPase(6) Đối với việc trị liệu, rabeprazole lại sử dụng dạng hỗn hợp racemic đồng phần R - (+) S - (-) Do khác tính chất dược lực học độc lực học đồng phân lập thể, việc phân biệt đồng phân quang học trở thành phần thiếu vấn đề nghiên cứu phát triển thuốc Do đó, việc cho đời phương pháp phân tích để tách xác định loại đồng phân quang học dược phẩm vô cần thiết Trong sách hướng dẫn Cơ quan quản lý Thực phẩm Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) tuyên bố cần thiết phải sử dụng phương pháp phân tích đặc hiệu bắt đầu nghiên cứu đồng phân thuốc Mặc dù phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) sử dụng nhiều báo cáo phân tách đồng phân quang học thuốc PPI(1,2,3) Theo tìm hiểu chúng tơi, việc định lượng đồng phân rabeprazole chủ yếu sử dụng hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao với đầu dò PDA(5) Do đó, mục đích nghiên cứu phát triển phương pháp phân tích đồng phân rabeprazole LC-MS/MS để hướng đến việc nghiên cứu dược động học đồng phân rabeprazole sau ĐỐITƯỢNG–PHƯƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU Đối tượng nghiên cứu Nguyên liệu rabeprazole công ty dược phẩm JW (Hàn Quốc) Trang thiết bị, hóa chất, dung mơi Trang thiết bị Hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao Shimadzu LC-20AD với đầu dò PDA Hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao Agilent 1200 Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch 373 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học với đầu dò MS/MS 4000 hãng AB Sciex Bể siêu âm Wiseclean Cân phân tích Sartorius BP221S Cột Chiralpak IC-3 (100 x 4,6 mm i.d., µm) với tiền cột Chiralpak IC-3 (10 ⅹ 4,0 mm i.d., µm) Daicel Hóa chất dung môi Chuẩn esomeprazole CTCBIO Inc (Hwaseong, Hàn Quốc), hóa chất đạt chuẩn dùng sắc ký lỏng n-hexan, ethanol, methanol, 2-propanol, tetrahydrofuran, acetonitril, n-butylamine ethylenediamine Daejung Monoethanolamine Junsei diethylamine Sigma-Aldrich Phương pháp nghiên cứu Tiến hành khảo sát để lựa chọn cột sắc ký phù hợp sử dụng hệ thống HPLC với đầu dò PDA Đồng thời tối ưu hóa điều kiện sắc ký dung môi sử dụng, tỉ lệ dung môi nhiệt độ cột Từ điều kiện ban đầu dùng để khảo sát n-hexan – ethanol – methanol – ethylenediamine (EDA) (10:80:10:0,1%, tt/tt/tt/tt), với tốc độ dòng 0,7 ml/phút nhiệt độ cột 35 0C với thể tích bơm mẫu 20 µl sử dụng đầu dò PDA với bước sóng phát 280 nm Các thông số sắc ký thời gian lưu, diện tích pic, hệ số phân giải hệ số bất đối xem xét Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng hiệu cao với đầu dò MS/MS lựa chọn esomeprazole làm chất nội chuẩn dùng để xây dựng quy trình phân tích Tối ưu thơng số đầu dò MS/MS kiểu ion hóa, curtain gas (CUR) khí khí (nitrogen) 20, 30, 40 psi, nhiệt độ buồng ion hóa 550 0C; điện mao quản 5500 V; declustering potential (DP) 55 V; collision energy (CE) collision cell exit potential (CXP) 19 V cho đồng phân rabeprazole, 76 V, 17 V 18 V cho IS hợp hệ thống, tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ lặp lại, độ xác liên ngày độ đúng(4) Chuẩn bị mẫu Dung dịch gốc Dung dịch gốc rabeprazole cân xác 10 mg rabeprazole cho vào bình định mức 100 ml, thêm 20 ml ethanol, siêu âm phút Thêm ethanol vừa đủ thể tích, lắc thu dung dịch có nồng độ 0,1 mg/ml Dung dịch gốc nội chuẩn esomeprazole (IS) cân xác 10 mg esomeprazole cho vào bình định mức 100 ml, thêm 20 ml ethanol, siêu âm phút Thêm ethanol vừa đủ thể tích, lắc thu dung dịch có nồng độ 0,1 mg/ml Tất dung dịch bảo quản tủ lạnh - 0C KẾT QUẢ Thăm dò cột sắc ký tối ưu hóa điều kiện sắc ký Sáu cột HPLC đồng phân khảo sát gồm cột Chiralpak OD-H (250 x 4,6 mm i.d., µm), cột Chiralpak AD-H (250 x 4,6 mm i.d., µm), Chiralpak OJ-H (150 x 4,6 mm i.d., µm), cột Sumichiral OA-4900 (250 x 4,6 mm i.d., µm), cột ChirobioticT (250 x 4,6 mm i.d., µm) cột Chiralpak IC-3 (100 x 4,6 mm i.d., µm) Hình minh họa sắc ký đồ tương ứng với cột Thời gian lưu, diện tích píc, hệ số phân giải hình dạng pic cột Chiralpak IC-3 (100 x 4,6 mm i.d., µm) điều kiện khảo sát tốt Và sử dụng cột để tiếp tục khảo sát điều kiện sắc ký lại Khảo sát điều kiện sắc ký dung môi sử dụng tỉ lệ dung mơi để tối ưu hóa tốc độ dòng 0,7 ml/phút, kết thể qua Bảng Từ kết pha động chọn hexan – ethanol – methanol – ethylenediamine (EDA) (10:80:10:0,1%, tt/tt/tt/tt) Quy trình định lượng sau xây dựng thẩm định theo ICH Q2 (R1) tính phù Bảng Kết thử nghiệm dung môi sử dụng tỉ lệ dung môi Hexan 10 10 374 Ethanol 90 90 Dung môi Methanol - EDA 0,2% 0,3% α 1,155 1,252 Thông số K' 0,781 0,659 N 3663 3412 RS 3,89 3,58 Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Hexan 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 Ethanol 90 90 90 90 90 90 80 80 80 95 95 45 60 70 70 80 80 Dung môi Methanol 45 30 20 20 10 10 EDA 0,3% 0,1% 0,2% 0,2% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% α 1,256 1,058 1,086 1,091 1,136 2,030 1,198 1,206 1,954 2,220 2,330 0,952 0,919 0,923 1,062 1,106 Chiralpak AD-H Chiralpak OD-H Thông số K' 0,665 1,003 0,982 0,855 0,780 2,020 0,840 0,896 1,156 2,016 2,019 0,680 0,722 0,496 0,505 0,916 0,672 N 3407 4407 4429 4690 4037 3106 4713 4793 3671 2789 2701 3785 3507 3093 3457 4839 3880 RS 3,58 4,48 4,50 4,23 4,00 4,07 3,68 3,73 4,20 3,87 3,85 1,46 1,91 2,09 2,16 4,49 3,44 Chiralpak OJ-H Chiralpak IC-3 ChirobioticT Sumichiral OA Nghiên cứu Y học Hình Sắc ký đồ khảo sát việc lựa chọn cột sắc ký đồng phân Bảng Kết thử nghiệm ảnh hưởng nhiệt độ cột Nhiệt độ ( C) 25 30 35 40 Rt1 (phút) 4,163 4,081 3,987 3,860 Rt2 (phút) 5,975 5,803 6,252 5,374 Ngoài ảnh hưởng nhiệt độ cột N1 N2 RS 3648 3845 3923 4016 3067 2515 4855 4818 5,126 4,745 5,433 5,472 khảo sát Kết biểu diễn qua Bảng Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch 375 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học Từ kết nhiệt độ cột 35 0C sử dụng Tối ưu hóa điều kiện HPLC với đầu dò MS/MS Điều kiện HPLC Sử dụng điều kiện HPLC tối ưu hóa cho việc phân tích đồng phân quang học rabeprazole MS/MS Pha động: hexan – ethanol – methanol – ethylenediamine (10:80:10:0,1%, tt/tt/tt/tt) Cột sắc ký: Chiralpak IC-3 (100 x 4,6 mm i.d., µm) Nhiệt độ cột: 35 0C Tốc độ dòng: 0,7 ml/phút Thể tích bơm mẫu: 10 µl Tối ưu thơng số đầu dò MS/MS Sử dụng MRM (multiple-reactionmonitoring) điều kiện tối ưu sau curtain gas, khí khí (nitrogen) 20, 40 psi, nhiệt độ buồng ion hóa 550 0C; điện mao quản 5500 V; declustering potential (DP) 55 V; collision energy (CE) collision cell exit potential (CXP) 19 cho đồng phân rabeprazole, 17 V cho IS Thu m/z rabeprazole có Q1 = 360,1 Q3 = 242,1 esomeprazole (IS) có m/z Q1 = 345,0 Q3=198,0 Thẩm định phương pháp Khảo sát tính phù hợp hệ thống Hệ số đối xứng có giá trị trung bình khoảng 0,8 – 1,5 Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) thông số sắc ký cho lần tiêm lặp lại so với nội chuẩn mẫu chuẩn nhỏ 2% Kết biểu diễn qua Bảng Vậy quy trình đạt tính phù hợp hệ thống Bảng Tính phù hợp hệ thống Thơng số Chất S-(-)- 376 RSD% RSD% AS RSD% thời gian diện tích píc số đĩa lý lưu (tR) (S) thuyết (N) 0,32 1,54 1,2 Rabeprazole R-(+)Rabeprazole 0,54 1,51 1,2 1,65 Khoảng tuyến tính giới hạn phát Từ dung dịch gốc pha dung dịch chuẩn có nồng độ 0,2, 0,3, 1, 3, 6, 10, 20, 40, 100 200 ng/ml cho rabeprazole dạng đồng phân ethanol Tiến hành sắc ký điều kiện khảo sát thu diện tích pic tương ứng với nồng độ Xử lý liệu excel 2007 cho thấy tương quan tuyến tính nồng độ diện tích đỉnh so với nội chuẩn Kết thể Bảng Với khoảng tuyến tính cho đồng phân từ 0,15 đến 100 ng/ml với hệ số tương quan R2 ≥ 0,999 Và có LOD 0,1 ng/ml LOQ 0,15 ng/ml cho đồng phân thể qua Hình Độ độ xác Độ tỉ lệ phục hồi S-(-)Rabeprazole từ 89,22 – 101,34% từ 89,18 – 101,68% cho R-(+)-Rabeprazole Đối với độ lặp lại S-(-)-Rabeprazole R-(+)-Rabeprazole 1,58% 1,59% Độ xác liên ngày (n=11) cho S-(-)-Rabeprazole 2,94% 3,04% cho R-(+)-Rabeprazole Kết thể qua Bảng Bảng Kết khảo sát độ đúng, độ xác, khoảng tuyến tính, LOD LOQ Giá trị thống kê S-(-)-Rabeprazole R-(+)-Rabeprazole Phương y = 0,0254x + 0,0205 y = 0,0232 x + 0,0161 2 trình hồi qui R = 0,9991 R = 0,9995 Khoảng 0,15 – 100 ng/ml 0,15 – 100 ng/ml tuyến tính LOD 0,1 ng/ml 0,15 0,1 ng/ml 0,15 ng/ml LOQ ng/ml Độ lặp lại 1,58% 1,59% (n=6) Độ xác liên 2,94% 3,04% ngày (n=11) Độ 89,22 – 101,34% 89,18 – 101,68% Chỉ tiêu thẩm định 1,62 Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Mẫu trắng Nghiên cứu Y học Nội chuẩn LOD Nội chuẩn Hình Sắc ký đồ mẫu trắng, nội chuẩn, S-(-)-Rabeprazole R-(+)-Rabeprazole LOD (0,1 ng/ml) Nộivàchuẩn LOQ LOQ (0,15 ng/ml) phân tách đồng phân quang học Bảng Kết khảo sát độ đúng, độ xác, rabeprazole khoảng tuyến tính, LOD LOQ Giá trị thống kê S-(-)-Rabeprazole R-(+)-Rabeprazole Phương y = 0,0254x + 0,0205 y = 0,0232 x + 0,0161 2 trình hồi qui R = 0,9991 R = 0,9995 Khoảng 0,15 – 100 ng/ml 0,15 – 100 ng/ml tuyến tính LOD 0,1 ng/ml 0,15 0,1 ng/ml 0,15 ng/ml LOQ ng/ml Độ lặp lại 1,58% 1,59% (n=6) Độ xác liên 2,94% 3,04% ngày (n=11) Độ 89,22 – 101,34% 89,18 – 101,68% TÀI LIỆU THAM KHẢO BÀN LUẬN Chỉ tiêu thẩm định Định lượng đồng phân rabeprazole LC-MS/MS phương pháp xác có độ nhạy cao, khoảng xác định rộng, việc định lượng mở hướng nghiên cứu dược động học đồng phân rabeprazole LCMS/MS Và việc nghiên cứu chất chuyển hóa đồng phân thể người KẾT LUẬN Phương pháp LC-MS/MS để tách phần đồng quang học rabeprazole phát triển thẩm định Phương pháp có tính chọn lọc, nhanh chóng tin cậy cao việc Chennuru LN, Choppari T, Duvvuri S, Dubey PK (2013) Enantiomeric separation of proton pump inhibitors on new generation chiral columns using LC and supercritical fluid chromatography J Sep Sci, 36:pp.3004 – 3010 Cirilli R, Ferretti R, Gallinella B, De Santis E, Zanitti L, La Torre F (2008) High-performance liquid chromatography enantioseparation of proton pump inhibitors using the immobilized amylose based Chiralpal IA chiral stationary phase in normal-phase, pholar organic and reversed-phase condition J Chromatogra A, 1177:pp.105 – 113 del Nozal MJ, Toribio L, Bernal JL, Alonso C, Jiménez JJ (2004) Chiral separation of omeprazole and several related benzimidazoles using supercritical fluid chromatography J Sep Sci, 27:pp.1023–1029 ICH Harmonised Tripartite Guideline (2005) Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use, pp.1-13 Kim M, Yu SK, Truong QK, Mai XL, Chung HK, Kang JS, Kim KH (2016) Determination of rabeprazole enantionmers in commercial tablets using immobilized cellulose-based stationary phase Archives of pharmacal research, 40:pp.373 – 381 Magotoshi M., Hideyuki T., Hideaki F., Noriaki T (1990) The potency of substituted benzimidazoles such as E3810, omeprazole, Ro 18-5364 to inhibit gastric H+, K(+) – ATPase is correlated with the rate of acid – activation of the inhibitor Biochem Pharmacol, 39:pp.661– 667 Ngày nhận báo: 31/01/2019 Ngày phản biện nhận xét báo: 12/02/2019 Ngày báo đăng: 20/04/2019 Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch 377 ... tiêu thẩm định Định lượng đồng phân rabeprazole LC -MS/MS phương pháp xác có độ nhạy cao, khoảng xác định rộng, việc định lượng mở hướng nghiên cứu dược động học đồng phân rabeprazole LCMS/MS Và... việc định lượng đồng phân rabeprazole chủ yếu sử dụng hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao với đầu dò PDA(5) Do đó, mục đích nghiên cứu phát triển phương pháp phân tích đồng phân rabeprazole LC -MS/MS. .. phải sử dụng phương pháp phân tích đặc hiệu bắt đầu nghiên cứu đồng phân thuốc Mặc dù phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) sử dụng nhiều báo cáo phân tách đồng phân quang học thuốc PPI(1,2,3)