Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội LỜI MỞ ĐẦU Theo tổ chức y tế thế giới, hiện nay căn bệnh tiểu đường (hay còn gọi là đái tháo đường) được xem là căn bệnh có số người mắc phải ngày càng tăng. Ngoài ra còn một số đông người mắc bệnh mà không hề biết. Theo dự đoán của tổ chức y tế thế giới (WHO) năm 2006 thì số lượng người mắc bệnh tiểu đường trên thế giới sẽ tăng lên khoảng 360 triệu người vào năm 2030 [22]. Đái tháo đường hay bệnh tiểu đường, là bệnh ngày càng phổ biến, gây nhiều biến chứng trầm trọng. Vì sau một thời gian bị bệnh tiểu đường mà không chữa trị kịp thời sẽ gây nhiều biến chứng: về tim mạch như cao huyết áp, xơ vữa động mạch, tai biến mạch máu não, nhồi máu cơ tim; về thận như đạm trong nước tiểu, suy thận; về mắt như đục thủy tinh thể, mù mắt; về thần kinh như dị cảm, tê tay chân hay nhiễm trùng: da, đường tiểu, lao phổi, nhiễm trùng bàn chân… thậm chí còn có thể gây đến tử vong [50]. Đái tháo đường xảy ra khi cơ thể không đủ sản xuất xuất đủ insulin, hoặc cơ thể giảm đáp ứng với tác dụng của insulin (đề kháng với insulin) [50]. Khi bị đái tháo đường, nồng độ đường trong máu tăng cao. Điều này có thể dẫn đến những vấn đề sức khỏe nghiêm trọng. Đó là lý do tại sao hạ thấp lượng đường trong máu là chìa khóa để quản lý bệnh đái tháo đường. Giữ lượng đường trong máu ổn định sẽ giúp giảm nguy cơ bị các biến chứng. Đường huyết cao có thể gây tổn hại cho cơ quan và tăng nguy cơ bị bệnh tim. Nguyễn Quỳnh Trang – KS.CNSH 07 – 01 1 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Ngày nay, người mắc bệnh tiểu đường ở Việt Nam ngày càng tăng, các loại thuốc chữa trị thì đa phần là nhập ngoại và đặc biệt là không có nguồn gốc tự nhiên. Nắm bắt được tình hình này và tính cấp bách của vấn đề, chúng tôi thực hiện đề tài: “Phân lập, tuyển chọn các chủng Bacillus subtilis có khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase và tối ưu các điều kiện nuôi cấy để thu chất ức chế α-glucosidase cao”. Nội dung đề tài gồm 3 phần : 1. Phân lập chủng Bacillus subtilis có khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase từ tương Nam Đàn. 2. Tuyển chọn chủng Bacillus subtilis có khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase cao và so sánh với các chủng phòng thí nghiệm. 3. Tối ưu điều kiện nuôi cấy chủng Bacillus subtilis có khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase. Nguyễn Quỳnh Trang – KS.CNSH 07 – 01 2 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội PHẦN I: TỔNG QUAN 1.1. Bệnh tiểu đường và các phương pháp điều trị Theo tổ chức y tế thế giới, thì tiểu đường : “là một hội chức có đặc tính biểu hiện là tăng lượng đường glucose trong máu do hậu quả của việc thiếu hoặc mất hoàn toàn insulin hoặc do có liên quan đến sự suy yếu trong bài tiết và hoạt động của insulin” [49]. Insulin là một loại hormon do tuyến tụy tiết ra nhằm cân bằng lượng glucose trong máu, nhưng vì một hoặc một vài lý do nào đó mà cơ thể thiếu hoặc không có insulin hoặc làm giảm hoạt động của insulin dẫn đến hàm lượng glucose trong máu tăng cao [49]. Hiệp hội đái tháo đường Hoa Kỳ đưa ra định nghĩa về tiểu đường: “Đái tháo đường là một nhóm các bệnh chuyển hóa có đặc điểm là tăng lượng glucose trong máu, hậu quả là sự thiếu hụt bài tiết insulin; khiếm khuyết trong hoạt động của insulin; hoặc cả hai. Tăng lượng glucose trong máu mãn tính thường kết hợp với sự hủy hoại, sự rối loạn chức năng và sự suy yếu chức năng của nhiều cơ quan, đặc biệt là mắt, thận, thần kinh, tim và mạch máu” [49]. Theo phân loại của WHO năm 1999, thì bệnh đái tháo đường có những thể loại sau: - Bệnh đái tháo đường type 1: Do tế bào bê – ta bị phá hủy, gây nên sự thiếu hụt insulin tuyệt đối cho cơ thể (nồng độ insulin giảm thấp hoặc mất hoàn toàn). Đái tháo đường type 1 chiểm tỷ lệ khoảng 5 – 10% bệnh đái tháo đường thế giới. Đái tháo đường type 1 phụ thuộc nhiều vào yếu tố gen (di truyền) và thường được phát hiện trước 40 tuổi. Đa số các trường hợp được chẩn đoán bệnh đái tháo đường type 1 thường là người có thể Nguyễn Quỳnh Trang – KS.CNSH 07 – 01 3 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội trạng gày, tuy nhiên người béo cũng không loại trừ. Người bệnh đái tháo đường type 1 sẽ có đời sống phụ thuộc insulin hoàn toàn [50]. - Bệnh đái tháo đường type 2: Do kháng insulin ở cơ quan đích kèm theo suy giảm chức năng tế bào bê – ta hoặc do suy giảm chức năng tế bào bê – ta kèm theo kháng insulin của cơ quan đích. Tùy trường hợp cụ thể mà một trong hai trường hợp trên nổi trội hoặc cả hai. Đái tháo đường type 2 chiếm tỷ lệ khoảng 90% đái tháo đường trên thế giới. Đái tháo đường type 2 không phụ thuộc nhiều vào yếu tố di truyền, và thường được phát hiện sau 40 tuổi. Người mắc bệnh đái tháo đường type 2 thường có thể trạng béo. Người mắc bệnh đái tháo đường type 2 có thế điều trị bằng cách thay đổi thói quen, kết hợp dùng thuốc để kiểm soát đường huyết, tuy nhiên nếu quá trình này thực hiện không tốt thì bệnh nhân cũng sẽ phải điều trị bằng cách dùng insulin [50]. Đối với người bị bệnh tiểu đường khi xét nghiệm đường máu lúc đói nồng độ đường có giá trị lớn hơn hoặc bằng 7,8mmol/l; nhưng thời gian gần đây tổ chức y tế thế giới đã đưa ra khuyến cáo chỉ số đường máu lớn hơn hoặc bằng 7mmol/l thì đã được chẩn đoán là đái tháo đường. Bởi vì, khi lượng đường trong máu lớn hơn hoặc bằng 7mmol/l thì người bệnh sẽ có nguy cơ mắc bệnh tim mạch và những nguy cơ khác có thể dẫn đến tử vong nếu không có sự can thiệp kịp thời [50]. Đái tháo đường là tình trạng bệnh mãn tính, kéo dài cần được theo dõi cẩn thận. Nếu không sẽ dẫn đến biến chứng phức tạp như bệnh tim mạch, suy thận, mù và tổn thương dây thần kinh [50]. Các biến chứng cấp : Một số biến chứng cấp tính có thể xãy ra khi đường huyết quá cao hay quá thấp. Nếu không được điều trị sớm có thể đe dọa tính mạng bệnh nhân. Bao gồm: Nguyễn Quỳnh Trang – KS.CNSH 07 – 01 4 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội - Tăng ketoacid máu do đái tháo đường Khi cơ thể ly giải chất béo sẽ tạo ra sản phẩm thừa chứa acid gọi là ceton. Cơ thể không thể chứa lượng ceton quá lớn nên sẽ tìm cách thải chúng qua nước tiểu. Khi cơ thể tạo ra quá nhiều, không thể thải hết tất cả qua nước tiểu, phần còn lại sẽ tích tụ trong máu gây tăng ketoacid máu do đái tháo đường. Đây là biến chứng rất nghiêm trọng do thiếu hóc môn insulin và chủ yếu xuất hiện ở bệnh nhân bị đái tháo đường type 1. - Hôn mê tăng áp lực thẩm thấu Bệnh nhân đái thái tháo đường không được điều trị sẽ mất rất nhiều dịch do đi tiểu nhiều. Gây ra tình tạng cô đặc máu làm áp lực thẩm thấu trong máu tăng cao. Bệnh thường gặp trên bệnh nhân đái tháo đường type 2. Có thể gây tử vong nếu không được điều trị thích hợp. - Tăng acid lactic trong máu Là do sự tích tụ acid lactic trong cơ thể. Nếu có quá nhiều acid lactic trong cơ thể, độ cân bằng sẽ bị phá vỡ và người bệnh bị toan acid máu. Bệnh này rất hiếm gặp và chủ yếu xuất hiện ở bệnh nhân bị đái tháo đường type 2. - Nhiễm nấm/vi khuẩn Bệnh nhân đái tháo đường dễ bị nhiễm nấm và vi khuẩn. Phụ nữ dễ bị nhiễm trùng tiểu, viêm hay nhiễm nấm âm đạo. Các biến chứng mãn tính: - Bệnh võng mạc (retinopathy) Bệnh võng mạc là nguyên nhân hàng đầu gây mù và rối loạn thị giác ở người trưởng thành trong xã hội phát triển. Khoảng 2% bệnh nhân mắc bệnh đái tháo đường trong 15 năm thì bị mù, nhưng đến khoảng 10% tiến triển thành chứng rối loạn thị giác nghiêm trọng. - Bệnh thận (nephropathy) Nguyễn Quỳnh Trang – KS.CNSH 07 – 01 5 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Đái tháo đường là nguyên nhân hàng đầu dẫn đến bệnh thận (tên khoa học là nephropathy). Khoảng 1/3 bệnh nhân đái tháo đường tiến triển thành bệnh thận và khoảng 20% bệnh nhân đái tháo đường type 1 bị suy thận. - Bệnh thần kinh (neuropathy) Bệnh thần kinh liên quan đến đái tháo đường xuất hiện tối thiểu ở phân nửa số bệnh nhân đái tháo đường. Có nhiều dạng bệnh thần kinh mà thường dẫn tới liệt bàn chân, một số ít ở bàn tay, đau chân hay các vấn đề liên quan đến chức năng các cơ quan trong cơ thể gồm tim, mắt, dạ dày, bàng quang và dương vật. Liệt bàn chân có thể làm cho người bệnh đái tháo đường tổn thương bàn chân họ mà không hề nhận ra. Những tổn thương này có thể gây hoại tử và có thể phải cắt bỏ bộ phận này. - Bệnh tim mạch Bệnh liên quan đến hệ tuần hoàn chiếm khoảng 75% các ca tử vong của bệnh nhân tiểu đường gốc Âu. Tại Mỹ, bệnh tim liên quan động mạch xuất hiện ở khoảng 8% đến 20% bệnh nhân đái tháo đường trên 45 tuổi. Nguy cơ mắc bệnh tim của những người này cao hơn gấp 2 đến 4 lần người thường. Đây cũng là nguyên nhân chính gây tàn tật và tử vong ở người bệnh đái tháo đường type 2 ở các nước công nghiệp hóa. - Phẫu thuật đoạn chi Bệnh đái tháo đường là nguyên nhân phổ biến nhất dẫn tới phải đoạn chi mà không do tai nạn. Bệnh nhân đái tháo đường có nguy cơ phải phẩu thuật cắt bỏ chi dưới gấp 15 đến 40 lần so với đại đa số dân chúng. Hiện nay, có rất nhiều phương pháp và các loại thuốc đặc hiệu để chữa trị bệnh tiểu đường như : tiêm insulin, dùng các loại thuốc nhóm Biguanide, nhóm Sulfonilurea, nhóm Thiazolidinedione, … Một trong những biện pháp điều trị là sử dụng thuốc có chứa chất ức chế αglucosidase như Acarbose, Glucobay, Miglitol,…[50]. Tuy nhiên các loại Nguyễn Quỳnh Trang – KS.CNSH 07 – 01 6 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội thuốc này có nhược điểm gây ra các tác dụng phụ cho người dùng như: đầy bụng, tiêu chảy, buồn nôn, bụng trướng và đau, ngứa, ngoại ban, chức năng gan bất thường,…[51]. Vì vậy, những năm gần đây, các chất ức chế αglucosidase sản xuất từ các nguồn tự nhiên được đặc biệt quan tâm vì chúng không gây độc, độ an toàn cao. Tuy nhiên các chất ức chế αglucosidase từ vi sinh vật được chú trọng hơn cả vì chúng có đặc điểm ưu việt: an toàn, có thể sản xuất trên quy mô công nghiệp, không phụ thuộc vào mùa vụ, chất lượng, địa điểm. 1.2. Giới thiệu về vi khuẩn Bacillus subtilis Chủng Bacillus subtilis được phát hiện bởi Ferdinand Cohn vào năm 1872 [8]. Bacillus subtilis là trực khuẩn, Gram dương, kích thước (3 – 5)×0,6µm, có khả năng sinh bào tử và là loài sinh vật tự dưỡng, hiếu khí hoặc kị khí tùy nghi [9]. Khả năng phát triển trong khoảng pH rộng 5,4 – 8,0 và khoảng nhiệt độ lớn 9 – 55oC. Các Bacillus subtilis có khả năng thuỷ phân nhanh chóng hầu hết các cơ chất có nguồn gốc động thực vật gồm xenlulose, tinh bột, pectin, protein, agar, hydrocacbon, gelatin…có khả năng lên men các loại đường như glucose, arabinose, xylose, manitol và có khả năng sử dụng citrat. Ngoài ra các chủng này còn có hoạt tính bacteriocin, tạo ra các chất subtilisin, tạo axit từ các đường, nitrat hoá, phản nitrat hoá, cố định nitơ, tự dưỡng, hô hấp tuỳ tiện, là vi khuẩn ưa axit, ưa kiềm, ưa nhiệt, ưa tối, sống ký sinh, hầu hết tạo bào tử nên có khả năng sống sót cao trong môi trường, ở bất kỳ nơi nào chúng chiếm ưu thế. Nguyễn Quỳnh Trang – KS.CNSH 07 – 01 7 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội 1.3. Giới thiệu về α-glucosidase - α-glucosidase là một loại enzyme thủy phân hoạt động ở pH tối ưu từ 4 – 4,5; phân cắt liên kết α-1→4, α-1→3, α-1→2 D-glucose ở đầu không khử của các disaccharide, oligosaccharide, polysaccharide và giải phóng ra D-glucose có thể hấp thu trực tiếp vào máu [53,36]. - Các tên gọi khác của α-glucosidase : maltase, glucoinvertase, glucosidosucrase, maltase-glucoamylase, glucosidoinvertase, α-D-glucosidase α-glucopyranosidase, , α-glucosidase hydrolase, α-1,4- glucosidase [53]. 1.4. Cơ chế tác dụng của α-glucosidase Phản ứng thủy phân của α-glucosidase: Maltose + H2O α-glucosidase 2 α-D-Glucose [35] Sự thủy phân α-glucosidase xảy ra với sự duy trì của các hóa chất lập thể tại trung tâm hoạt động [37]. Sự duy trì và tái tạo enzyme là nhờ hai nhóm acid carboxylic ở trung tâm hoạt động và sử dụng cơ chế đổi chỗ với chất trung gian là enzyme β-glucosyl. Cả hai bước trong quá trình là sự chuyển hóa trạng thái với sức bền của các liên kết ion giữa oxy và cacbon [38]. Một carboxylic ở trung tâm hoạt động sẽ hoạt động như chất xúc tác ưa nhân, gây ảnh hưởng đến sự hình thành các liên kết cộng hóa trị trung gian, trong khi một acid carboxylic khác có vai trò của một chất xúc tác acid ở trong bước đầu tiên và là cơ sở xúc tác cho bước thứ hai (thủy phân chất trung gian là enzyme β-glucosyl) [39]. α-glucosidase có hoạt động tối ưu ở pH axit nhưng chức năng của nó vẫn chưa được hiểu rõ [28]. Nguyễn Quỳnh Trang – KS.CNSH 07 – 01 8 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội α-glucosidase có hai họ lớn đặc trưng lớn đó là: GH13 và GH31 và hai họ nhỏ là GH4 và GH97 theo hệ thống phân loại CAZY của các loại enzyme thủy phân glucozit [49]. 1.5. Chất ức chế α-glucosidase (alpha glucosidase inhibitors: AGIs) 1.5.1. Lịch sử nghiên cứu chất ức chế α-glucosidase Năm 1970, người ta nhận ra rằng việc sử dụng các chất ức chế αglucosidase có thể kiểm soát sự hấp thu carbonhydrate và giúp hỗ trợ điều trị cho những người bị mắc bệnh tiểu đường một cách hiệu nghiệm. Bản chất của các chất ức chế α-glucosidase là các flavonoids, pseudooligosaccharide, thiosugars… có nguồn gốc chủ yếu ở thực vật và vi sinh vật [10]. Các nhà nghiên cứu của Bayer tìm ra loài Actinoplanes SE50 có khả năng tổng hợp các chất ức chế sucrase có tên là Acarbose. Nó có thể gây ức chế quá trình chuyển hóa đường, Acarbose cũng có hiệu quả đối với chuột và những tình nguyện viên [12]. Acarbose là một tetrasacharide chống đái tháo đường, ức chế men αglucosidase ruột đặc biệt là sucrase, làm chậm tiêu hóa và hấp thu carbohydrat. Kết quả là glucose máu tăng chậm hơn sau khi ăn, giảm nguy cơ tăng glucose máu, và nồng độ glucose máu ban ngày dao động ít hơn. Khi dùng liệu pháp một thuốc, Acarbose làm giảm nồng độ trung bình của hemoglobin glycosylat (vào khoảng 0,6 đến 1%). Giảm hemoglobin glycosylat tương quan với giảm nguy cơ biến chứng vi mạch ở người đái tháo đường. Acarbose không ức chế men lactase và không gây mất dung nạp lactose. Acarbose không làm tăng tiết insulin và không gây giảm glucose máu lúc đói khi dùng đơn trị liệu ở người. Vì Acarbose chủ yếu làm chậm hơn là ngăn cản hấp thu glucose, thuốc không làm mất nhiều calo trong lâm sàng và không gây sụt cân ở cả người bình thường và người đái Nguyễn Quỳnh Trang – KS.CNSH 07 – 01 9 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội tháo đường. Acarbose có thể thêm vào để giúp cải thiện kiểm soát glucose máu ở người bệnh điều trị ít kết quả bằng các liệu pháp thông thường. [59]. Hình 1: Cấu trúc hóa học của Acarbose [10] Năm 1984, người ta đã sản xuất Valiolamine từ loại vi khuẩn Streptomyces hygroscopicus và chất này có khả năng ức chế maltase và sucrase với giá trị IC50 là 2,2 µM và 0,049 µM [13]. Các dẫn xuất chứa Nitơ của Valiolamine được tổng hợp để làm tăng khả năng ức chế α-glucosidase trong phòng thí nghiệm và tìm ra một loại dẫn xuất đơn giản là Viglibose. Viglibose là chất tạo thành bởi sự khử nhóm amin của Valiolamine với dihydroxyacetone, được coi là một chất chống tiểu đường có hiệu quả cao [14]. Giá trị IC 50 của chất này với maltase và sucrase là 0,015 µM và 0,0046µM [10]. Hình 2: Cấu trúc hóa học của Valiolamine và Voglibose [10] Năm 1966 Nojirimycin đã được phát hiện ra là chất đầu tiên tương tự như glucose với nguyên tử nito ở vị trí của vòng oxy [15]. Nguyễn Quỳnh Trang – KS.CNSH 07 – 01 10 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Hình3: Cấu trúc hóa học của Nojirimycin [10] Nojirimycin là chất đầu tiên được coi như là một chất kháng sinh được tổng hợp bởi Streptomyces roseochromogenes R-468 và S.lavendulae SF-425 và được chỉ ra là chất có khả năng ức chế α-glucosidase và βglucosidase [16]. Tuy nhiên, bởi vì các loại đường nhóm imino này liên kết với nhóm −OH ở vị trí cacbon thứ nhất khá là ổn định, nó thường được giữ với các hợp chất bisulfite hoặc có thể làm giảm phản ứng hydro hóa với chất xúc tác là Platinum hoặc bởi NaBH 4 tới 1-deoxynojrimycin (DNJ) [17]. Sau này DNJ được phân lập từ rễ cây dâu tằm và được gọi là monanoline [18]. DNJ cũng được sản xuất bởi nhiều chủng Bacillus và Streptomyces [19,20,21]. Mặc dù trong điều kiện in vitro kết quả ức chế αglucosidase là rất cao nhưng hiệu quả trong điều kiện in vivo chỉ ở mức vừa phải [22]. Vì vậy, một số lượng lớn các dẫn xuất của DNJ đã được chuẩn bị với hi vọng hiệu quả trong điều kiện in vivo tăng. Vì vậy sản phẩm có chứa 1-deoxynojrimycin được đưa ra thị trường với tên gọi là Miglitol đã được chọn là chất có khả năng ức chế lớn nhất trong điều kiện in vivo. Miglitol khác với Acarbose ở chỗ nó gần như được hấp thụ hoàn toàn ở trong đường ruột và có thể có những hiệu ứng tác động lên các hệ thống tiếp giáp với đường ruột [23]. Hai chất Salacinol và Kotalanol đã được các nhà khoa học Nhật Bản nghiên cứu và nhận thấy đó là chất có thành phần có khả năng ức chế αglucosidase được lấy từ dung dịch nước hòa tan với rễ và thân cây Salacia reticulata [24,25]. Nguyễn Quỳnh Trang – KS.CNSH 07 – 01 11 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Hình 4: Cấu trúc hóa học của Salacinol và Kotalanol [10] Giá trị IC50 của Salacinol trong nghiên cứu về maltase, sucrase và iso-maltase ở chuột là 3,2; 0,84; 0,59µg/µl. Các hoạt tính ức chế đối với maltase và sucrase gần với Acarbose và iso maltase có hoạt tính ức chế mạnh hơn cả Acarbose. Chất Kotalanol cho hoạt tính ức chế mạnh hơn cả Salacinol và Acarbose đối với Sucrase. Hơn nữa, khi nghiên cứu hoạt tính của Salacinol trên chuột còn thấy được khả năng ức chế mạnh hơn sự tăng trưởng nồng độ đường trong máu hơn cả Acarbose [25]. Việc nghiên cứu và sản xuất các chất ức chế α-glucosidase hiện nay đã đang và vẫn được các nhà khoa học chú ý. Đặc biện chú ý hơn là các nguồn nguyên liệu tự nhiên và sẵn có. Nguyễn Quỳnh Trang – KS.CNSH 07 – 01 12 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội 1.5.2. Cơ chế tác dụng của AGIs trong điều trị tiểu đường type 2 Hình 5: Cơ chế tác dụng của AGIs trong điều trị tiểu đường [54] Tinh bột hoặc đường (sucrose) có thành phần quan trọng là carbonhydrate và là một cấu tử gồm kết hợp của hai hoặc nhiều loại đường (glucose hoặc fructose). Trong cơ thể chúng ta hầu như không thể hấp thu trực tiếp được các loại carbonhydrate đó. Vì vậy các loại carbonhydrate đó (di, oligo, poly saccharide) đó phải được thủy phân hoàn toàn bởi các loại enzyme tiêu hóa để các saccharide được thủy phân thành các dạng mà cơ thể có thể hấp thu [54]. Trước hết, tinh bột bị enzyme amylase trong nước bọt chuyển hóa thành maltose (sự kết hợp của hai phân tử glucose). Đường sucrose và maltose sẽ bị một loại enzyme có tên là α-glucosidase sẽ thủy phân các saccharide thành các D-glucose mà cơ thể hấp thu được ở niêm mạc ruột. Các chất ức chế enzyme có đặc tính ức chế hoạt động của α-glucosidase. Nói cách khác, nhờ sự hiện diện của các chất ức chế thì glucose và Nguyễn Quỳnh Trang – KS.CNSH 07 – 01 13 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội fructose khó được sản xuất từ maltose và sucrose tại ruột và dạ dày. Do đó, sự hấp thu carbonhydrate qua niêm mạc ruột là rất nhỏ. Việc này có tác dụng kiềm chế tăng lượng đường trong máu được giữ ở mức thấp [54]. Người ta đã biết rõ các AGIs tác dụng cản trở quá trình chuyển hóa từ các loại di, oligo, poly saccharide thành D-glucose. Điều này làm giảm lượng glucose trong máu và không hề gây phản xạ tăng tiết insulin. α-glucosidase có trung tâm hoạt động chứa acid carboxylic. AGIs là chất ức chế cạnh tranh (như Acarbose), nó gắn vào trung tâm hoạt động của α-glucosidase làm giảm hoạt lực enzyme, ngăn chặn không cho αglucosidase thủy phân các loại di, oligo và poly saccharide thành Dglucose, để điều hòa lượng đường trong máu [36]. 1.5.3. Tình hình nghiên cứu, sản xuất, ứng dụng AGIs 1.5.3.1. Trên thế giới Có rất nhiều hãng dược phẩm trên thế giới đã đưa ra thị trường rất nhiều loại thuốc có chức năng ức chế α-glucosidase. Đầu tiên phải nói đến hãng Glucobay của Đức, năm 1990 hãng đã cho giới thiệu trên thị trường một loại thuốc có chứa Acarbose được sử dụng cho những người bị bệnh tiểu đường (non – insulin − dependent diabetes mellitus − NIDDM) và đã gặt hái được những thành công lớn trên thị trường Châu Âu và Mỹ La Tinh. Năm 1996, Acarbose được sản xuất nhờ chủng Actinoplanes SE50. Từ đó, Acarbose được coi như là một loại thuốc giúp hỗ trợ cho những người bị bệnh tiểu đường trong gần 40 năm [10]. Từ năm 1994 Vogibose đã được hãng Basen giới thiệu như một sản phẩm để giúp điều trị tiểu đường ở Nhật Bản [10]. Năm 1996, Miglitol (của Glyset) được Hiệp hội Quản lý Dược và Thực phẩm của Mỹ đồng ý cấp phép lưu hành và giới thiệu trên thị trường Nguyễn Quỳnh Trang – KS.CNSH 07 – 01 14 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội năm 1999. Kể từ đó được coi là một loại thuốc có khả năng ức chế αglucosidase được dùng phổ biến thứ 2 trên thế giới với một vài ảnh hưởng nhỏ lên dạ dày [10]. Trên thế giới hiện nay vẫn và đang nghiên cứu rất nhiều loại thuốc hay thực phẩm chức năng có chứa AGIs để hỗ trợ cho phòng và chữa bệnh tiểu đường. 1.5.3.2. Ở Việt Nam Ở Việt Nam hiện nay tỉ lệ người mắc bệnh tiểu đường ngày càng gia tăng. Tuy nhiên, việc sản xuất thuốc chữa theo hướng ức chế α-glucosidase vẫn chưa có bất kì sản phẩm nào. Những loại thuốc hay thực phẩm chức năng có chứa AGIs trên thị trường ở Việt Nam toàn bộ đều là các sản phẩm nhập khẩu hoàn toàn từ nước ngoài. Các loại thuốc chữa trị tiểu đường ở Việt Nam đa phần là thuốc đông y chiết xuất từ một số loại cây thuốc có tác dụng giảm đường huyết như: dây thìa canh, giảo cổ lam, … Hiện nay, Việt Nam đang tiến hành nghiên cứu khảo sát hoạt tính ức chế α-glucosidase từ nấm mốc, vi khuẩn và cây lá sữa …. để ứng dụng trong điều trị tiểu đường . Nguyễn Quỳnh Trang – KS.CNSH 07 – 01 15 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị 2.1.1. Nguồn phân lập Các mẫu tương Nam Đàn. 2.1.2. Chủng giống Các chủng Bacillus subtilis của phòng thí nghiệm bộ môn vi sinh – hóa sinh – sinh học phân tử – Viện công nghệ sinh học & công nghệ thực phẩm, trường đại học Bách Khoa Hà Nội: f1nh, f1bd, B3C, Natto, BCN2M, BCN2Đ. 2.1.3. Hóa chất * Hóa chất sử dụng trong phân lập tuyển chọn: Pepton, cao nấm men, NaCl, agar, nước cất, thuốc nhuộm (xanh metylen, fucshin, lugol, tím gential), toluen, dầu soi kính… * Hóa chất sử dụng trong thử hoạt tính ức chế α-glucosidase: glucose, nước cất, tinh bột tan, DNS, NaOH, muối K – Na Tartrate, phenol, Na2S2O5… 2.1.4. Thiết bị, dụng cụ - Box cấy (Viet Nam) - Cân điện tử (Sartorius CP224S, Nhật Bản) - Kính hiển vi quang học (OLYMPUS-Model CHS, Nhật Bản) - Máy ly tâm (Đức) - Máy đo quang (Ultrospec 2000, Pharmacia Biotech) - Nồi thanh trùng (HIRAYAMA, Nhật Bản) - Tủ nuôi lắc (Nhật Bản) - Tủ sấy (Nhật Bản) - Lò vi sóng (Samsung, Hàn Quốc) Nguyễn Quỳnh Trang – KS.CNSH 07 – 01 16 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội - Tủ lạnh (SANYO, Nhật Bản) - Máy votex (Labnet) - Máy đo pH (Thụy Sỹ) - Tủ bảo ôn (SHELLAB) … 2.1.5. Môi trường - Môi trường phân lập: Luria – Bertani (LB): Cao nấm men : 5g Peptone : 10g NaCl : 5g Agar : 15 – 20g Nước cất : 1000ml - Chế độ thanh trùng: 121ºC trong 15 phút. - Môi trường giữ giống: Giữ giống trên môi trường LB thạch trong ống thạch nghiêng. - Môi trường phân lập: môi trường LB thạch trong đĩa peptri. - Môi trường nuôi lắc: môi trường LB lỏng. 2.2. Phương pháp thực hiện 2.2.1. Phương pháp phân lập * Nguyên tắc: Ta tiến hành pha loãng ở các nồng độ khác nhau rồi cấy trang ra các đĩa petri. * Cách tiến hành: - Lấy khoảng 10ml mẫu (tương Nam Đàn) cho vào bình tam giác 250ml, đun đến 70ºC và giữ trong 10 phút. Nguyễn Quỳnh Trang – KS.CNSH 07 – 01 17 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội - Dùng micropipet hút 100μl dịch từ mẫu rồi chuyển sang một eppendorf có chứa sẵn 900μl nước cất vô trùng. - Tiếp tục pha loãng ở các nồng độ 10 -2, 10-3,…10-7 ở những ống eppendorf tiếp theo. - Ghi vào nắp đĩa petri đã đổ môi trường thạch các thông tin: nồng độ pha loãng, ngày cấy. - Dùng micropipet hút 100μl dung dịch đã pha loãng cho vào mỗi đĩa thạch. Mỗi nồng độ cấy vào 2 đĩa petri. - Dùng que trang trang thật đều trên bề mặt thạch. - Bọc các đĩa thạch đã cấy bằng giấy gói sau đó đặt vào trong tủ nuôi ở 37ºC. Sau 2 ngày lấy ra kiểm tra hình thái khuẩn lạc, tiến hành nhuộm để kiểm tra bào tử (trước khi nhuộm tiến hành sốc nhiệt, hoặc có thể để vào tủ lạnh trước khoảng 2 ngày). - Cấy ria những khuẩn lạc đặc trưng thu được vào các đĩa peptri. Cấy ria đến khi thuần giống thì tiến hành giữ giống trên ống thạch nghiêng. 2.2.2. Phương pháp bảo quản giống Ở nhiệt độ thấp, sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật bị hạn chế. Do vậy, chúng tôi tiến hành nuôi ở 37oC trong 48h rồi bảo quản giống ở điều kiện lạnh trong môi trường ống thạch nghiêng LB ở 4 oC. Sau 1 – 2 tháng cấy chuyển một lần để tránh sự giảm hoạt tính của vi sinh vật. 2.2.3. Phương pháp nhuộm bào tử * Nguyên tắc: Sự bắt màu thuốc nhuộm của tế bào vi sinh vật là 1 quá trình hấp phụ. Phần lớn vi sinh vật bắt màu bền vững. Thuốc nhuộm thường dùng là các chất aminlin (chủ yếu là loại kiềm hoặc trung tính). Vì thành phần tế bào của mỗi vi sinh vật khác nhau nên khả năng bắt màu cũng rất khác nhau. Nguyễn Quỳnh Trang – KS.CNSH 07 – 01 18 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội * Cách tiến hành: - Làm vết bôi và cố định vết bôi bằng cách hơ trên ngọn lửa đèn cồn. - Nhuộm xanh metylen theo loffler: Nhỏ 1 giọt xanh metylen, hơ nóng đến sôi nhẹ và giữ như vậy trong 15 − 20 giây. - Rửa bằng nước cất, nhuộm lại bằng fucshin giữ khoảng 30 giây. Sau đó rửa bằng nước cất, hơ khô. Nhỏ 1 giọt dầu soi rồi quan sát dưới vật kính dầu 100X. - Kết quả: tế bào bắt màu hồng, bào tử bắt màu xanh. 2.2.4. Phương pháp nhuộm Gram - Làm vết bôi và cố định vết bôi bằng cách hơ trên ngọn lửa đèn cồn. - Nhỏ 1 giọt tím gential lên trên vết bôi, giữ trong khoảng 1 − 2 phút, rửa bằng nước cất, thấm khô. - Nhỏ dung dịch lugol lên trên vết bôi, giữ trong 1 phút rồi rửa cồn, thấm khô (hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn). - Nhỏ 1 giọt fucshin lên vết bôi, giữ trong 12 phút. Sau đó rửa nước, thấm khô. Nhỏ 1 giọt dầu soi rồi quan sát dưới vật kính dầu 100X. - Kết quả: vi khuẩn Gram (+) bắt tím, vi khuẩn Gram (−) bắt màu hồng. 2.2.5. Khảo sát khả năng ức chế α-glucosidase từ các chủng Bacillus subtilis bằng phương pháp đục lỗ thạch * Nguyên tắc: Phương pháp khảo sát khả năng ức chế α-glucosidase được tiến hành dựa trên phương pháp đo đường kính vòng thủy phân tạo thành sau khi cho α-glucosidase thủy phân tinh bột đồng thời bổ sung canh trường nuôi cấy vi khuẩn có chứa chất ức chế α-glucosidase. Đường kính vòng Nguyễn Quỳnh Trang – KS.CNSH 07 – 01 19 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội thủy phân đo được càng nhỏ chứng tỏ khả năng ức chế α-glucosidase càng cao. * Cách tiến hành: Pha môi trường LB có sung 2% tinh bột tan. Đĩa thạch được đục lỗ đường kính 0,5cm. Hút 10µl α-glucosidase vào lỗ, sau đó bổ sung canh trường lỏng nuôi từng loại Bacillus subtilis vào từng lỗ. Sau đó ủ đĩa thạch ở 37oC trong 24h rồi lấy ra nhuộm bằng thuốc thử lugol. Khả năng ức chế α-glucosidase được biểu thị tương đối bằng cách xác định đường kính vòng thủy phân. 2.2.6. Phương pháp xác định hoạt tính ức chế α-glucosidase từ canh trường nuôi của các chủng Bacillus subtilis * Nguyên tắc: Phương pháp xác định hoạt tính ức chế α-glucosidase được tiến hành dựa trên phương pháp xác định hàm lượng đường glucose tạo thành sau khi cho α-glucosidase thủy phân tinh bột và cho thêm canh trường nuôi cấy vi sinh vật chứa chất ức chế α-glucosidase. Hàm lượng glucose được xác định bằng phương pháp DNS. Khi lượng glucose tạo thành càng ít thì giá trị hấp thụ màu của phản ứng DNS ở bước sóng 540nm càng thấp. Hoạt tính ức chế α-glucosidase dựa trên độ giảm khả năng hấp thụ màu của hỗn hợp. * Phương pháp xác định hoạt tính ức chế α-glucosidase: Hoạt tính ức chế α-glucosidase được xác định theo công thức: % ức chế = · 100 (%) (*) Trong đó: A: là hàm lượng glucose tạo thành khi α-glucosidase thủy phân tinh bột, không có sự tham gia của chất ức chế. Nguyễn Quỳnh Trang – KS.CNSH 07 – 01 20 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội B: là hàm lượng glucose tạo thành sau khi α-glucosidase thủy phân tinh bột có sự tham gia của chất ức chế. C: là hàm lượng đường glucose có sẵn trong canh trường nuôi vi khuẩn. * Cách tiến hành: - Xác định A trong công thức (*): + Phản ứng thủy phân: 300μl maltose 1% phản ứng với 10μl αglucosidase và 50µl nước cất lắc đều giữ phản ứng ở 37ºC trong bóng tối 30 phút, sau đó đun sôi trong 5 phút để dừng phản ứng ta thu được dịch thủy phân 1. + Phản ứng DNS: 250μl dịch thủy phân 1 + 750μl nước cất + 1ml dung dịch DNS đun sôi trong 10 phút sau đó làm nguội dưới vòi nước lạnh và đem đo OD ở bước sóng 540nm. Xây dựng đường chuẩn glucose có phương trình: y = ax + b Dựa vào phương trình đường chuẩn glucose, ta xác định được hàm lượng đường tạo thành trong dịch thủy phân 1 là A (mg/ml). Từ đó ta có công thức tính hàm lượng đường glucose trong các dịch thủy phân là: X = · D · (mg/ml) Trong đó: OD: là giá trị OD đo ở bước sóng 540nm ứng với từng dịch thủy phân thu được. D: là độ pha loãng (trong trường hợp này D = 1). V: là thể tích dịch thủy phân trong phản ứng DNS (ml). - Xác định B trong công thức (*) : Nguyễn Quỳnh Trang – KS.CNSH 07 – 01 21 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội + Phản ứng thủy phân: 300μl maltose 1% phản ứng với 10μl αglucosidase và 50μl canh trường nuôi cấy vi khuẩn (ly tâm ở 6000 vòng/phút trong 15 phút thu lấy dịch ở bên trên) lắc đều giữ phản ứng ở 37ºC trong bóng tối 30 phút, sau đó đun sôi trong 5 phút để dừng phản ứng ta thu được dịch thủy phân 2. + Phản ứng DNS: 250μl dịch thủy phân 2 + 750μl nước cất + 1ml dung dịch DNS đun sôi trong 10 phút sau đó làm nguội dưới vòi nước lạnh và dem đo OD ở bước sóng 540nm. Dựa vào phương trình đường chuẩn glucose ta xác định được hàm lượng đường tạo thành trong dịch thủy phân 2 là B (mg/ml). - Xác định C trong công thức (*) : Phản ứng DNS: 250μl dịch canh trường nuôi cấy vi khuẩn + 750μl nước cất + 1ml dung dịch DNS đun sôi trong 10 phút sau đó làm nguội dưới vòi nước lạnh và đem đo OD ở bước sóng 540nm. Dựa vào phương trình đường chuẩn glucose ta xác định được hàm lượng đường tạo thành trong dịch canh trường nuôi cấy vi khuẩn là C (mg/ml). 2.2.7. Xây dựng đường cong sinh trưởng của các chủng Bacillus subtilis dựa vào đo mật độ quang * Nguyên lý chung : Vi sinh vật khi phát triển làm đục môi trường. Dựa vào độ hấp thụ quang khác nhau ở các nồng độ tế bào khác nhau theo thời gian sinh trưởng. Do đó muốn xác định lượng tế bào cần xây dựng đường cong sinh trưởng dựa vào giá trị mật độ quang ở bước sóng 620 nm (OD620nm). * Cách tiến hành : Hoạt hóa chủng, tiến hành tiếp giống vào bình tam giác có chứa 100 ml môi trường LB . Tiến hành nuôi lắc trong điều kiện 37 0C. Cứ 2h thì lấy mẫu 1 lần và đo OD620nm. Từ giá trị OD thu được ta xây dựng được đường cong sinh trưởng. Nguyễn Quỳnh Trang – KS.CNSH 07 – 01 22 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội 2.2.8. Tối ưu các điều kiện nuôi cấy thích hợp cho các chủng Bacillus subtilis để thu được hoạt tính ức chế α-glucosidase cao theo phương pháp cổ điển Chủ yếu dựa vào kinh nghiệm của người nghiên cứu: lần lượt thay đổi từng thông số, trong khi cố định các yếu tố còn lại. Phương pháp này chỉ cho phép xác định riêng biệt mối phụ thuộc giữa chỉ tiêu đánh giá và các yếu tố ảnh hưởng khi làm riêng rẽ từng thí nghiệm. Tiến hành tối ưu ba yếu tố của phản ứng thử hoạt tính ức chế αglucosidase: nồng độ cơ chất, pH, nhiệt độ. Lần lượt thay đổi từng yếu tố, trong khi cố định các yếu tố còn lại. Mỗi thí nghiệm tiến hành khảo sát khả năng ức chế α-glucosidase ở điều kiện khác nhau. 2.2.8.1. Tối ưu điều kiện nhiệt độ Hoạt động sống của vi khuẩn có thể coi là kết quả của các phản ứng hoá học vì các phản ứng này phụ thuộc chặt chẽ vào nhiệt độ. Nên yếu tố nhiệt độ, rõ ràng ảnh hưởng sâu sắc đến các quá trình sống của tế bào. Và mỗi loài vi khuẩn có nhiệt độ phát triển tối thích khác nhau. Xác định nhiệt độ tại đó vi khuẩn tăng trưởng nhanh, phát triển mạnh và cho hoạt tính cao. * Tiến hành: Trong nghiên cứu này, nhiệt độ thích hợp của Bacillus subtilis được xác định bằng cách nuôi vi khuẩn trong môi trường LB lỏng ở các nhiệt độ 30oC, 35oC, 40oC, 45oC, sau đó tiến hành xác định hoạt tính ức chế αglucosidase từ canh trường của Bacillus subtilis sau khoảng thời gian 6h/lần. 2.2.8.2. Tối ưu điều kiện pH Mỗi loại vi khuẩn có pH phát triển tối thích khác nhau. Do đó, tiến hành xác định pH mà tại đó vi khuẩn sinh trưởng, phát triển mạnh và cho hoạt tính cao. Nguyễn Quỳnh Trang – KS.CNSH 07 – 01 23 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội * Tiến hành: Xác định pH thích hợp của Bacillus subtilis bằng cách nuôi vi khuẩn trong môi trường LB lỏng ở các pH 4; 4,5; 5; 6; 7; 8; 9, sau đó tiến hành xác định hoạt tính ức chế α-glucosidase từ canh trường của Bacillus subtilis sau khoảng thời gian 6h/lần. 2.2.8.3. Tối ưu nồng độ cơ chất Sự thay đổi hàm lượng dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng đến hoạt động sống của vi sinh vật. Trong thành phần môi trường LB có cao nấm men và peptone là nguồn dinh dưỡng chính (Cacbon và Nitơ) cho Bacillus subtilis. Mặt khác, theo các nghiên cứu trước đó cho thấy khi sử dụng đậu tương làm nguồn dinh dưỡng thay cho cao nấm men và peptone để nuôi Bacillus subtilis vẫn cho hoạt tính ức chế α-glucosidase. Để khảo sát hàm lượng chất dinh dưỡng thu hoạt tính ức chế α-glucosidase cao và tiết kiệm chi phí, tiến hành thay môi trường dinh dưỡng lần lượt là đậu xanh, đậu tương, đậu đen (có hàm lượng protein cao) cho cao nấm men và peptone đồng thời khảo sát hoạt tính ức chế α-glucosidase. * Tiến hành: - Xác định Nitơ tổng số có trong cao đậu xanh, đậu tương, đậu đen bằng phương pháp Kjendahl: * Nguyên tắc: Trước hết mẫu được vô cơ hóa bằng H 2SO4 đậm đặc ở bằng nhiệt độ cao với chất xúc tác. Các phản ứng của quá trình vô cơ hóa mẫu xảy ra như sau: H 2 SO4 → 2 H 2O + SO2 + O2 Nguyễn Quỳnh Trang – KS.CNSH 07 – 01 24 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Oxy tạo thành lại oxy hóa các nguyên tố khác: Cacbon tạo thành CO2, hydro tạo thành H2O, còn nito giải phóng ra dưới dạng NH 3 kết hợp với H2SO4 dư tạo thành (NH4)2SO4. Đuổi NH3 ra khỏi dung dịch bằng cách NaOH ( NH 4 ) 2 SO4 + 2 NaOH → Na2 SO4 + H 2O + 2 NH 3 Khí NH3 thoát ra với nước sang bình hứng chứa H3BO3 2 NH 4OH + 4 H 3 BO3 → ( NH 4 ) 2 B4O7 + 7 H 2O Định lượng H3BO3 dư bằng H2SO4 0,1 N * Tiến hành: Vô cơ hóa nguyên liệu. Mẫu đậu: Tiến hành ngâm đậu để dễ tách vỏ. Cân 100g nghiền trong 1000ml nước. Tiến hành thanh trùng bảo quản. Hút 1ml cho vào bình Kjendal và bổ sung 10 – 20ml axit đậm đặc. Bổ sung vài giọt xúc tác, chỉ cho vào giai đoạn cuối khi mẫu có màu vàng sẫm. Đốt cho đến khi thu dịch trong. Để nguội. Chuyển dịch sang bình định mức 50ml hoặc 100ml tráng bình Kejdal vài lần bằng nước cất không có Nitơ và định mức tới ngấn bình. * Chưng cất: Sử dụng H3BO3 3% để thu nhận NH3: Rửa bình chưng cất Kjeldahl bằng nước cất không chứa nito. Lấy 10 – 20ml dung dịch đã vô cơ hóa cho vào bình phản ứng. Cho thêm vài giọt thuốc thử nếu dùng xúc tác H2O2. Cho vào bình hứng 20ml dung dịch H 3BO3 3% bổ sung vài giọt Taxiro. Nguyễn Quỳnh Trang – KS.CNSH 07 – 01 25 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Tiến hành chạy máy tự động cất đạm Sau đó tiến hành định lượng amoni tetraborat tạo thành bằng dung dịch H2SO4 chuẩn 0,1N cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt. * Tính toán kết quả: Nt = 6.25.(a − b).0,14.V m.V1 - Thay cao nấm men và peptone bằng dịch đậu tương, đậu xanh, đậu đen với tỉ lệ Nitơ tổng số lần lượt là 0%, 1%, 2%, 5%, 10% và khảo sát hoạt tính ức chế α-glucosidase ở các tỉ lệ đó. Nguyễn Quỳnh Trang – KS.CNSH 07 – 01 26 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập các chủng Bacillus subtilis từ tương Nam Đàn Sau 3 lần phân lập từ các mẫu tương Nam Đàn thu được 13 chủng, đặc điểm hình thái khuẩn lạc thể hiện ở bảng 1. Bảng 1. Kết quả phân lập các chủng Bacillus subtilis từ tương Nam Đàn STT Chủng 1 T1 2 T2 3 T3 4 T4 5 T5 6 T6 7 T7 8 T8 9 T9 10 T10 11 T11 12 T12 13 T13 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc Màu trắng ngà, bề mặt trơn, có gợn nhăn thành vòng tròn, mép bờ răng cưa. Màu trắng ngà, bề mặt trơn, mép bờ không tròn đều. Màu trắng đục, viền ngoài màu trắng ngà, bề mặt trơn, mép bờ răng cưa. Màu trắng ngà, bề mặt trơn, có gợn nhăn thành vòng tròn, mép bờ tròn đều. Màu trắng ngà, bề mặt trơn, có gợn thành vòng tròn giống như nhân, mép bờ răng cưa. Màu trắng ngà, bề mặt váng, nhân hơi lồi, mép bờ không tròn đều, hơi răng cưa. Màu trắng đục, bề mặt váng, mép bờ không tròn đều,hơi răng cưa. Màu trắng ngà, hình hoa tuyết, mép bờ tia hình cây, bề mặt nhăn, gợn. Màu trắng trong, phát triển lan theo bề mặt, hình cây, mép bờ tia hình cây. Màu trắng đục, khuẩn lạc hơi tròn, bề mặt gợn, mép bờ răng cưa. Màu trắng đục hơi ngả vàng, viền ngoài màu trắng ngà, bề mặt hơi lồi, mép bờ hơi nhăn. Màu trắng đục, bề mặt nhăn, mép bờ không tròn đều. Màu trắng ngà, đường kính khuẩn lạc khoảng, bề mặt váng, mép bờ răng cưa. Nguyễn Quỳnh Trang – KS.CNSH 07 – 01 Kích thước (mm) 7–8 4–5 13 – 14 3 2 3–4 13 – 14 4 – 6 3 5–6 3–4 27 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội  Hầu hết các chủng phân lập được đều có màu trắng, kích thước không đồng đều (2 – 14mm), mép bờ tròn hoặc răng cưa, khuẩn lạc hơi nhăn, trơn nhẵn hoặc hơi lồi. 3.2. Nhuộm màu Gram và bào tử Sau khi nuôi cấy 48h, tiến hành sốc nhiệt hoặc để lạnh rồi nhuộm bào tử và Gram để quan sát bào tử và phân biệt vi khuẩn G(+), G(–) bằng xanh metylen, fucshin, lugol, tím gential. Kết quả nhuộm được thể hiện ở bảng 2. Bảng 2. Kết quả nhuộm màu Gram và bào tử STT Chủng Nhuộm bào tử Nhuộm Gram 1 T1 Trực khuẩn, có bào tử, tạo chuỗi. 2 T2 Trực khuẩn, kích thước nhỏ, không có bào tử. – 3 T3 Trực khuẩn, kích thước không đồng nhất, tạo ít bào tử. G(+) 4 T4 Trực khuẩn, hai đầu hơi thon,tạo thành chuỗi, có bào tử. G(+) 5 T5 Trực khuẩn, hai đầu thon dài, có bào tử G(+) 6 T6 Trực khuẩn, có bào tử. G(+) 7 T7 Trực khuẩn, không có bào tử. – 8 T8 Trực khuẩn, kích thước nhỏ hơn so với các mẫu khác, không có bào tử. – 9 T9 Trực khuẩn, có bào tử. G(+) 10 T10 Trực khuẩn, có bào tử. G(+) 11 T11 Trực khuẩn , tạo thành chuỗi, có nhiều bào tử. G(+) 12 T12 Trực khuẩn, không có bào tử. 13 T13 Trực khuẩn, hai đầu thon, có nhiều bào tử. Nguyễn Quỳnh Trang – KS.CNSH 07 – 01 G(+) – G(+) 28 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Bào tử Hình 6: Bào tử của chủng phân lập  Các chủng phân lập đều là trực khuẩn, trong đó 9 chủng có bào tử và là vi khuẩn G(+). Bào tử hình bầu dục, phân bố lệch tâm, gần tâm nhưng không chính tâm. 3.3. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase từ canh trường nuôi cấy của các chủng phân lập Kết quả khảo sát khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase từ canh trường nuôi cấy của các chủng phân lập bằng phương pháp đục lỗ thạch được thể hiện ở bảng 3. Bảng 3. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase từ canh trường nuôi cấy của các chủng phân lập Chủng vi khuẩn T1 T3 T4 T5 T6 T9 T10 T11 T13 ĐKVTP D (mm) 15 25 22 20 16 21 14 18 12 0,83 1,39 1,22 1,11 0,89 1,17 0,78 1,00 0,67 D/d Đường kính vòng thủy phân mẫu đối chứng d=18 mm Nguyễn Quỳnh Trang – KS.CNSH 07 – 01 29 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Khả năng ức chế α-glucosidase từ canh trường nuôi cấy của chủng T13: Hình 7: Đường kính vòng thủy phân chủng T13  Kết quả khảo sát hoạt tính ức chế α-glucosidase cho thấy, chủng T 3 có đường kính vòng thủy phân lớn nhất là 25mm, chủng T 13 có đường kính vòng thủy phân nhỏ nhất là 12mm nên khả năng ức chế α-glucosidase của chủng T13 là cao nhất. Do đó, chọn chủng T 13 để tiếp tục nghiên cứu hoạt tính ức chế α-glucosidase. Hình ảnh của chủng T13: Hình 8: Hình thái khuẩn lạc của chủng T13 Nguyễn Quỳnh Trang – KS.CNSH 07 – 01 30 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội 3.4. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase từ canh trường nuôi cấy của 6 chủng Bacillus subtilis và chủng T13 Sau 24h giờ nuôi cấy ở 30oC, tiến hành khảo sát khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase từ 6 chủng Bacillus subtilis và chủng T13 thu được kết quả như sau: Hình 9: Khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase (Tham khảo bảng P – 2)  Từ kết quả khảo sát khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase từ canh trường nuôi cấy của 6 chủng Bacillus subtilis và chủng T13, nhận thấy các chủng đều có hoạt tính ức chế α-glucosidase. Trong đó chủng BCN2M có hoạt tính ức chế thấp nhất (15,21%) , chủng Natto có hoạt tính ức chế cao nhất (70,61%). Do đó, chọn chủng Natto để tiến hành tối ưu điều kiện nuôi cấy. 3.5. Kết quả tối ưu điều kiện nuôi cấy chủng Natto * Kết quả tối ưu nhiệt độ Tiến hành khảo sát khả năng sinh trưởng phát triển và sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase từ canh trường nuôi cấy của chủng Natto ở các nhiệt độ khác nhau trong các khoảng thời gian khác nhau. Nguyễn Quỳnh Trang – KS.CNSH 07 – 01 31 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Hình 10: Khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase từ canh trường nuôi cấy của chủng Natto ở 30oC (Tham khảo bảng P – 3)  Qua khảo sát khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase từ canh trường nuôi cấy của chủng Natto ở 30oC nhận thấy, chủng Natto cho hoạt tính ức chế α-glucosidase cao nhất là 78,47% ở pha phát triển lũy tiến. Hình 11: Khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase từ canh trường nuôi cấy của chủng Natto ở 35oC (Tham khảo bảng P – 4) Nguyễn Quỳnh Trang – KS.CNSH 07 – 01 32 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội  Qua khảo sát khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase từ canh trường nuôi cấy của chủng Natto ở 35oC nhận thấy, chủng Natto cho hoạt tính ức chế α-glucosidase cao nhất là 78,47% ở cuối pha phát triển lũy tiến. Hình 12: Khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase từ canh trường nuôi cấy của chủng Natto ở 40oC (Tham khảo bảng P – 5)  Qua khảo sát khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase từ canh trường nuôi cấy của chủng Natto ở 40oC nhận thấy, chủng Natto cho hoạt tính ức chế α-glucosidase cao nhất là 82,23% ở cuối pha phát triển lũy tiến. Nguyễn Quỳnh Trang – KS.CNSH 07 – 01 33 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Hình 13: Khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase từ canh trường nuôi cấy của chủng Natto ở 45oC (Tham khảo bảng P – 6)  Qua khảo sát khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase từ canh trường nuôi cấy của chủng Natto ở 45oC nhận thấy, chủng Natto cho hoạt tính ức chế α-glucosidase cao nhất là 57,68% ở pha cân bằng.  Kết luận: Qua kết quả khảo sát khả năng sinh tổng hợp chất ức chế αglucosidase từ canh trường nuôi cấy của chủng Natto ở các nhiệt độ khác nhau, nhận thấy chủng Natto thường cho hoạt tính ức chế α-glucosidase cao ở cuối pha phát triển lũy tiến. Trong đó, chủng Natto cho hoạt tính ức chế α-glucosidase thấp nhất ở 45oC (57,68%), cao nhất ở 40oC (82,23%). Điều đó cho thấy nhiệt độ có ảnh hưởng khá lớn đến tốc độ sinh trưởng, phát triển và khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase. Chủng Natto cho hoạt tính ức chế α-glucosidase cao nhất ở 40 oC nên chọn nhiệt độ tố ưu là 40oC. Nguyễn Quỳnh Trang – KS.CNSH 07 – 01 34 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội * Kết quả tối ưu pH Hình 14: Khảo sát ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase từ canh trường nuôi cấy của chủng Natto (Tham khảo bảng P – 7, P – 8, P – 9, P – 10, P – 11, P – 12, P – 13)  Kết luận: Qua khảo sát ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase từ canh trường nuôi cấy của chủng Natto ở dải pH 4 – 9, nhận thấy ở các pH khác nhau chủng Natto đều có hoạt tính ức chế α-glucosidase. Trong đó, chủng Natto cho hoạt tính ức chế α-glucosidase thấp nhất ở pH 9 (71,48%), cao nhất ở pH 5 (83,73%). Điều đó cho thấy chủng Natto có khả năng phát triển trong khoảng pH rộng. Tuy nhiên, pH ít có ảnh hưởng đến hoạt tính ức chế α-glucosidase. Qua kết quả thu được, chọn pH tối ưu là 5. * Kết quả tối ưu nồng độ cơ chất Hàm lượng Nitơ tổng có trong cơ chất (đậu tương, đậu đen, đậu xanh) được xác định bằng phương pháp Kjendahl. Kết quả thể hiện trong bảng 4. Nguyễn Quỳnh Trang – KS.CNSH 07 – 01 35 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Bảng 4. Hàm lượng Nitơ tổng có trong cơ chất Cơ chất Hàm luợng Nitơ tổng Đậu xanh 32% Đậu đen 28% Đậu tương 34% Peptone 14% Cao nấm men 74% - Tiến hành khảo sát khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase từ canh trường nuôi cấy của chủng Natto sử dụng các cơ chất: đậu đen, đậu xanh, đậu tương với hàm lượng Nitơ tổng 1,5%. Hình 15: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ cơ chất đến khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase (Tham khảo bảng P – 14, P – 15, P – 16)  Qua khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính ức chế α-glucosidase từ chủng Natto, nhận thấy sử dụng cơ chất đậu tương cho Nguyễn Quỳnh Trang – KS.CNSH 07 – 01 36 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội hoạt tính ức chế α-glucosidase cao nhất (70,60%). Vì vậy, chọn đậu tương làm cơ chất để tiếp tục tiến hành nghiên cứu. - Tiến hành khảo sát khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase từ canh trường nuôi cấy của chủng Natto sử dụng cơ chất đậu tương. Hình 16: Khảo sát khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase từ canh trường nuôi cấy của chủng Natto sử dụng cơ chất đậu tương (Tham khảo bảng P – 17, P – 18, P – 19, P – 20, P – 21)  Kết luận: Qua khảo sát khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase từ canh trường nuôi cấy của chủng Natto sử dụng cơ chất đậu tương với hàm lượng Nitơ tổng là 5% cho hoạt tính ức chế cao nhất là 85,75%. Nguyễn Quỳnh Trang – KS.CNSH 07 – 01 37 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1.Kết luận Từ những kết quả nghiên cứu bước đầu, chúng tôi đã có một số kết luận: - Từ mẫu tương Nam Đàn, phân lập được 13 chủng, trong đó 9 chủng có xuất hiện bào tử và là trực khuẩn G(+), do đó lựa chọn 9 chủng này thực hiện cấy ria và giữ giống để tiếp tục nghiên cứu. - Qua khảo sát khả năng sing tổng hợp chất ức chế α-glucosidase từ 9 chủng phân lập được, nhận thấy chủng T13 có đường kính vòng thủy phân nhỏ nhất. Vì vậy, chọn chủng T13 để tiếp tục tiến hành nghiên cứu. - Qua khảo sát khả năng sing tổng hợp chất ức chế α-glucosidase từ canh trường nuôi cấy của chủng T 13 và 6 chủng do phòng thí nghiệm cung cấp, cho thấy chủng Natto có hoạt tính ức chế α-glucosidase cao nhất là 70,61%. Do đó, lựa chọn chủng Natto để tiếp tục tiến hành nghiên cứu. - Canh trường nuôi cấy chủng Natto cho hoạt tính ức chế αglucosidase cao nhất ở 40oC (82,23%), pH 5 (83, 73%), sử dụng cơ chất đậu tương với hàm lượng Nitơ 5% (85,75%). 4.2. Kiến nghị Do điều kiện và thời gian nghiên cứu có hạn, nên nếu có thời gian nghiên cứu tiếp chúng tôi có một số kiến nghị như sau: - Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ lắc đến sự sinh trưởng phát triển và hoạt tính ức chế α-glucosidase từ chủng Natto. - Thu, tách và tinh sạch chất kìm hãm để ứng dụng trong điều trị bệnh tiểu đường. Nguyễn Quỳnh Trang – KS.CNSH 07 – 01 38 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyển, Phạm Văn Ty (1997), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục. 2. Lê Thanh Mai (2005), Các phương pháp phân tích ngành công nghệ lên men, NXB Khoa học kỹ thuật. 3. PGS.TS Nguyễn Xuân Thành, Vũ Thị Hoàn, Nguyễn Thế Bình, Đinh Hồng Duyên (2007), Giáo trình thực tập vi sinh chuyên ngành, Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội. 4. Nguyễn Lân Dũng, Bùi Thị Việt Hà (2009), Sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật, NXB Giáo dục. 5. Lương Đức Phẩm (1998), Công nghệ vi sinh vật, NXB Khoa học kỹ thuật. 6. Nguyễn Lân Dũng, Bùi Thị Việt Hà (2009), “Dinh dưỡng của vi sinh vật”, Vietsciences. 7.(62) Phan Thị Trân Châu, Nguyễn Thị Hiền, Bùi Gia Tường (1997), Thực hành hoá sinh học, NXB Giáo dục. 8. Nguyễn Thị Xuân Hiền, “Nghiên cứu khả năng chịu nhiệt của bào tử và enzym protease của Bacillus subtilis”, khóa luận tốt nghiệp, Đại học Bách Khoa Đà Nẵng. 9. Lê Xuân Phương (2001), Vi sinh vật học công nghiệp, NXB Xây dựng Hà Nội. Nguyễn Quỳnh Trang – KS.CNSH 07 – 01 39 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Tài liệu tiếng Anh 10. Naoki Asano (2003), “Glycosidase inhibitors: update and perpectives on practical use”, Glycobiology vol.13 no.10 pp. 93R - 104R. 11. Schimidt D.D, Former W, Muller L, Junge B, Wingender W, and Truscheit E (1997), “ α-glucosidase inhibitor, new complex oligosaccharides of microbial origin”, Naturwissenshaften, 64: 535 - 536. 12. Puls W, Keup U, Krause H.P, Thomas G, anf Hoffmeister F (1977), “Glucosidase inhibition. Α new approach to the treatment of dibetes, obesity, and hyperlipoproteinaemia”, Naturwissenshaften, 64: 536 - 537. 13. Kameda Y, Asano N, Yoshikawa M, Takeuchi M, Yamaguchi T, Matsui K, Horri S, and Fukase H (1984), “Valiolamine, α-glucosidase new α-glucosidase ihibiting aminocyclitol produced by Steptomyces hygroscopicus”, The Journal of Antibiot, 37: 1301 - 1307. 14. Horri S, Fukase H, Matsuko T, Kameda Y, Asano N, and Matsui K (1986), “Synthesis and α- D-glucosidase inhibitory activity of N-subtituted valiolamine derivatives as potential oral antidiabetic agents”, J. Med.Chem., 29:1038 - 1046. 15. Inoue S, Tsuruoka T, and Niida T (1996), “The structure of nojirimycin, a piperidinoise sugar antibiotic”, J . Antibiot., 19: 288 - 292. 16. Niwa T, Inoue S, Tsuruoka T, Koaze Y, and Niida T (1970), “ “Nojirimycin” as α-glucosidase potent inhibitor of glucosidase”, Agric. Biol. Chem., 34: 966 - 968. 17. Inuoe S, Tsuruoka T, Ito T and Niida T (1967), “Structure and synthesis of nojirimycin”, Tetrahedron, 23: 2125 - 2144. 18. Yagi M, Kouno T, Aoyagi Y, and Murai H (1976), “The structure of molanoline, a piperidine alkaloid from Morus species”, Nippon nogei Kagaku Kaishi, 50: 571 - 572. Nguyễn Quỳnh Trang – KS.CNSH 07 – 01 40 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội 19. Schmidt D.D, Frommer W, Muller L, and Truscheit E (1979), “Glucosidase inhibitors from bacilli”, Naturwissenshaften, 66: 584 - 585. 20. Murao S and Miyata S (1980), “Isolation and characterization of αglucosidase new trahalase inhibitor”, S-GI. Agric. Biol. Chem., 44: 219 221. 21. Ezure Y, Murao S, Miyazaki K and Kawamata M (1985), “Molanoline (1-deoxynojimycin) fermentation and its improvement”, Agric. Biol. Chem., 49: 1119-1125. 22. Junge B, Matzke M, and Stlteuss J (1996), “Chemistry and structure activity relationships of glucosidase inhibitors”, In Kuhmann J and Puls W (Eds), Handbook of experimental pharmacology, vol.199. Springer-Verlag New York, pp. 411-482. 23. Joubert P.H, Foukaridis G.N and Bopape M.L (1987), “Miglitol may have blood glucose lowering effect unrelated to inhibition of αglucosidase”, Eur. J . Clin. Pharmacol., 31: 723-724. 24. Yoshikawa M, Murakami T, Shimada H, Matsuda H, Yamahara J, Tanabe G and Muraoka O (1997), “Salacinol, potent antidiebetic principle with unique thiosugar sulfonium sulfate structure from the ayurvedic tradition medicine Salacia reticulata in Sri Lanka and India”, Tetrahadron Lett., 38: 8367-8370. 25. Yoshikawa M, Murakami T, Yashiro K, and Matsuda H (1998), “Kotalanol, and potent α-glucosidase inhibitor with thiosugar sulfonium sulfate structure, from antidiabet ayurvedic medicine Salacia reticulata”. Chem. Pharm. Bull., 46: 1339- 1340. 26. Yamasaki Y, Suzuki Y (1980), “Two forms of α-glucosidase from sugar beet sedds”, Planta 148: 354-361. 27. Yamasaki Y, Konno H (1985), “Two forms of α-glucosidase from soybean callus”, Agric Biol Chem., 49: 849-850. 28. Fry S.C (1995), “Poly saccharide-modifying enzymes in the plant cell wall”, Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol., 46: 497-520. Nguyễn Quỳnh Trang – KS.CNSH 07 – 01 41 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội 29. Matsui H, Chiba S, Shimomura T (1979), “Substrate specificity of an αglucosidase in sugar beet seed,. Agric Biol Chem., 42: 1855-1860. 30. Chiba S, Kanaya K, Hiromi K, Shimomura T (1979), “Substrate specificity and subsite affinities of buckwheat α-glucosidase”, Agric Biol Chem., 43: 237-242. 31. Briggs D.E (1978), “The biochemistry of barley”, In barley pp 89-173, Chapman & Hall, London. 32. Sissons M.J, MacGreor Α.W (1994), “Hydrolysis of barley starch granules by α-glucosidase from malt”, J Ceral Sci 19: 161-169. 33. Yamasaki Y, Konno H, Mashima H (1996), “Purification and properties of α-glucosidase from millet seeds”, Phytochemistry 41: 703-705. 34. Sun Z, Duke SH, Henson CA (1995), “The role of pea chloroplast αglucosidase in trasitory starch degradation”, Plant Physiol 108: 211-217. 35. Enzymatic assay of α-glucosidase (EC.3.2.1.20). 36. Yun-Ping Zhu, Li-Jun Yin, Yong-Qiang Cheng, Kohji Yamaki, Yutaka Mori, Yi-Cheng Su, Li-Te Li (2007), “ Effects of sources of carbon and nitrogen on production of α-glucosidase inhibitor by a newly isolated strain of Bacillus subtilis B2”, 737-742.. 37. Chiba S, Hiromi K, Minamiura N, Ohnishi M, Shimomura T, Suga K, Suganuma T, Tanaka Α, Tomioka S and Yamamoto T (1979), “Quantitative study on anomeric forms of glucose produced by αglucosidase”, J Biochem(Tokyo), 85: 1135-1141. 38. McCarter, J.D and Withers, S.G (1994), “Mechanism of enzymeatic glucoside hydrolysis”, Curr Opin Struct Biol 4: 885-892. 39. Davies GJ and Henrissat B (1995), “Structure and mechanism of glycosyl hydrolases”, Structure 3: 853-859. 40. U.F Wehmeier, W. Piepersberg (2004), “Biotechnology and molecular biology of the α-glucosidase inhibitor Acarbose”, Appl Microbiol Biotechnology, 63: 613-625. Nguyễn Quỳnh Trang – KS.CNSH 07 – 01 42 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội 41. Jing Chen, Yong-Qiang Chen, Kohji Yamaki, Li-Te Li (2007), “Anti αglucosidase activity of Chinese traditionally fermented soybean (Douchi)”, Food chemistry 103: 1091-1096. 42. Johoji Yamahara (2002), “Compound with α-glucosidase inhibiting action and method for producing the same” Unted States Application Publication, US 2002/0041904 A1. 43. Vinitha Moolchand Thadani, Karunaratne, Muhammad Iqbal Choudhary (2008), “Novel α-glucosidase inhibitors from lichens”, Unted States Patent Application Publication, US 2008/0318916 A1. 44. Janaswamy Madhusudana Rao, Jagadeeshwar Rao, Sampath Kumar, Singireddy Vankat Reddy, Ashok Kumar Tiwari (2004), “Α-glucosidase inhibitors and their synthesis from a natural source”, Unted States Patent Application Publication, US 2004,0171674 A1. 45. Medical Plants, vol 2, p330, 1995. 46. Hiroshi Tsuboi, Shuji Ikegami, Zai-si Ji, Hiroyuki Itou, Munehiro Oda, Karuo Shin (2007), “α-glucosidase activity inhibitor”, Unted States Patent Application Publication, US 2007/0036872 A1. 47. Sumio Terada, Kikui Itoh, Naoto Noguchi, Takashi Ishida (2009), “Alpha glucosidase inhibitor, inhibitor for blood glucose level elevation and fuctional food containing tricaffeoylaldaric acid and method for producing tricaffeoylaldaric acid”, Unted States Patent Application Publication, US 2009,0209649 A1. 48. Janaswamy Madhusudana Rao, Pullela Venkata Srinivas, Vummenthala Anuradha, Ashok Kumar Tiwari, Amtul Zehra Ali, Jhillu Singh Yadav, Kondapuram Vijaya Raghavan (2002), “Α-glucosidase inhibitors from a natural source”, Unted States Patent Application Publication, US 7.081.260 B2. 49. Tsuyoshi Shirai, Vo Si Hung, Katsuhito Morikana, Tohru Kobaytashi, and Susumu Ito, “Crystal structure of GH13 α-glucosidase GSJ from one of the deepest sea bacteria” ,126-133. Nguyễn Quỳnh Trang – KS.CNSH 07 – 01 43 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Tài liệu internet: 50. http://www.daithaoduong.net.vn 51. http://www.tudienthuoc.net 52. http://www.nhipcauykhoa.net 53. http://www.sigmaaldrich.com 54. http://www.nippon-sapuri.com 55. http://www.endotex.org 56. http://www.rushakoff.com 57. http://www.medical-dictionary.thefrredictionary.com 58. http://www.vocw.edu.vn 59. http://bacsygiadinh24h.com Nguyễn Quỳnh Trang – KS.CNSH 07 – 01 44 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội PHỤ LỤC I. Cách pha các dung dịch cần thiết I.1.Dung dịch DNS DNS (3,5 dinitro salicylic) : 10,6g NaOH : 19,8g Nước cất : 1416ml Hòa tan 3 chất trên sau đó thêm vào: Muối K - Na Tartrate : 306g Phenol (nóng chảy ở 50ºC) : 7,6ml Sodium metabisulphate (Na2S2O5) : 8,3g I.2. Dung dịch lugol Iodine :1g Potassium iodine :2g Nước cất : 300 ml Iodine và KI cần nghiền nhỏ trước khi hòa tan từ từ trong nước cất và giữa trong chai tối. I.3. Dung dịch α- glucosidase α-glucosidase code G0660 của Sigma, ≥ 125 Units/mg. Enzyme được cung cấp dưới dạng bột đã bao gồm đệm kali phosphate pH = 7,15. Enzyme được pha trong nước đề ion lạnh đã thanh trùng thành dung dịch enzyme với hoạt lực 1,25 U/ml.  Cách pha: Cân 1mg α- glucosidase hòa tan vào 1ml nước đề ion đã thanh trùng được dung dịch 1 (125 U/ml), lấy 100μl dung dịch 1 hòa vào 900μl nước đề ion được dung dịch 2 (12,5 U/ml), lấy 100μl dung dịch 2 hòa vào 900μl Nguyễn Quỳnh Trang – KS.CNSH 07 – 01 45 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội nước đề ion được dung dịch 3 (1,25 U/ml). Toàn bộ các thao tác trên được thực hiện trong điều kiện vô trùng và giữ lạnh. Dung dịch 1 được bảo quản ở −20ºC, dung dịch 2 và 3 được bảo quản ở 2 − 8ºC. II. Xây dựng đường chuẩn glucose Từ dung dịch glucose 1% ta tính toán để thu được thể tích glucose có nồng độ cần dùng: Bảng P - 1: Kết quả dựng đường chuẩn glucose STT 1 2 3 4 4 6 Nồng độ glucose (mg/ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Dung dịch glucose 1% (μl) 0 20 40 60 80 100 Nước cất Dung dịch (μl) DNS (μl) 2000 1980 1960 1940 1920 1900 2000 2000 2000 2000 2000 2000 OD540nm 0 0,341 0,960 1,559 1,999 2,378 Hình P - 1: Phương trình đường chuẩn glucose III. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase Nguyễn Quỳnh Trang – KS.CNSH 07 – 01 46 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Bảng P - 2: Khảo sát khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase Chủng OD1 B OD2 C % ức chế f1nh 1,061 0,214 0,079 0,012 23,08% f1bđ 1,130 0,229 0,076 0,011 17,15% B3C 0,823 0,165 0,067 0,009 40,76% Natto 0,455 0,089 0,079 0,012 70,61% BCN2M 1,172 0,237 0,088 0,014 15,21% BCN2Đ 0,654 0,130 0,071 0,010 54,4% T13 0,868 0,175 0,078 0,012 38% III. Tối ưu điều kiện nuôi cấy chủng Natto IV.1. Nhiệt độ - Giá trị OD của dịch thủy phân α-glucosidase OD =1,305 thay vào phương trình đường chuẩn với y là giá trị OD, x là hàm lượng glucose tương ứng ta được A= 0,2647 - Giá trị OD của canh trường nuôi cấy vi khuẩn là 0,098 thay vào phương trình đường chuẩn với y là giá trị OD, x là hàm lượng glucose tương ứng ta được C = 0,0157. Nguyễn Quỳnh Trang – KS.CNSH 07 – 01 47 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Bảng P - 3: Khảo sát khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase từ canh trường nuôi cấy của chủng Natto ở 30oC Thời gian (h) Hoạt tính ức chế ĐCST OD/540nm Hàm lượng đường % ức chế OD/620nm 0 1,138 0,230 18,93% 0,025 12 1,006 0,203 29,22% 0,973 18 0,374 0,073 78,47% 1,425 24 0,914 0,184 36,39% 1,560 30 1,024 0,207 27,78% 1,594 36 1,090 0,220 22,68% 1,603 42 1,143 0,231 18,54% 1,611 Bảng P - 4: Khảo sát khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase từ canh trường nuôi cấy của chủng Natto ở 35oC Thời gian (h) OD/540nm Hoạt tính ức chế Hàm lượng đường % ức chế OD/620nm 0 1,315 0,267 15.47% 0,236 12 1,109 0,224 29.41% 0,879 18 0,537 0,106 68.11% 1,367 24 0,445 0,087 74.34% 1,654 30 0,871 0,175 45.52% 1,762 36 0,925 0,186 41.86% 1,781 42 1,177 0,238 24.81% 1,785 Nguyễn Quỳnh Trang – KS.CNSH 07 – 01 ĐCST 48 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Bảng P - 5: Khảo sát khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase từ canh trường nuôi cấy của chủng Natto ở 40oC Thời gian (h) Hoạt tính ức chế ĐCST OD/540n m Hàm lượng đường % ức chế OD/620nm 0 0,871 0,175 39,74% 0,321 12 0,831 0,166 43,36% 0,996 18 0,735 0,147 50,36% 1,347 24 0,604 0,120 60,56% 1,598 30 0,326 0,063 82,23% 1,791 36 0,400 0,078 76,45% 1,835 42 0,641 0,128 57,68% 1,863 48 1,282 0,206 28,20% 1,859 Bảng P - 6: Khảo sát khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase từ canh trường nuôi cấy của chủng Natto ở 45oC Thời gian (h) Hoạt tính ức chế ĐCST OD/540nm Hàm lượng đường 0 1,506 0.300 2,96% 0,045 12 1,009 0.200 36,13% 0,721 18 0,87 0.171 45,40% 1,129 24 0,765 0.150 52,41% 1,427 30 0,686 0.134 57,68% 1,484 36 0,741 0.145 54,01% 1,480 42 1,171 0.232 25,32% 1,475 Nguyễn Quỳnh Trang – KS.CNSH 07 – 01 % ức chế OD/620nm 49 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội IV.2. pH Bảng P - 7: Khảo sát khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase từ canh trường nuôi cấy của chủng Natto ở pH 4 Thời gian (h) OD/540nm Hàm lượng đường % ức chế 0 1,332 0,270 13,99% 6 1,128 0,228 28,12% 12 0,995 0,201 37,33% 18 0,817 0,164 49,65% 24 0,945 0,190 40,79% 30 0,495 0,098 71,95% 36 1,106 0,224 29,64% 42 1,161 0,235 25,83% Bảng P - 8: Khảo sát khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase từ canh trường nuôi cấy của chủng Natto ở pH 4,5 Thời gian (h) OD/540nm Hàm lượng đường % ức chế 0 6 12 18 24 30 36 42 1,356 1,201 0,936 1,002 0,966 0,457 0,823 1,199 0,275 0,243 0,189 0,202 0,195 0,090 0,165 0,243 12,33% 23,06% 41,41% 36,84% 39,33% 74,58% 49,24% 23,20% Bảng P - 9: Khảo sát khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase từ canh trường nuôi cấy của chủng Natto ở pH 5 Nguyễn Quỳnh Trang – KS.CNSH 07 – 01 50 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Thời gian (h) OD/540nm Hàm lượng đường % ức chế 0 6 12 18 24 30 36 42 1,469 1,104 0,969 0,431 0,375 0,290 0,337 0,951 0,299 0,223 0,195 0,084 0,073 0,055 0,065 0,192 3,44% 28,30% 37,49% 74,13% 77,95% 83,73% 80,43% 38,72% Bảng P - 10: Khảo sát khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase từ canh trường nuôi cấy của chủng Natto ở pH 6 Thời gian (h) OD/540nm 0 6 12 18 24 30 36 42 1,203 1,220 1,024 0,935 0,592 0,394 0,809 0,578 Hàm lượng đường % ức chế 0,244 0,247 0,207 0,188 0,118 0,077 0,162 0,115 21,55% 20,40% 33,75% 39,81% 63,17% 76,65% 48,39% 64,12% Nguyễn Quỳnh Trang – KS.CNSH 07 – 01 51 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Bảng P - 11: Khảo sát khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase từ canh trường nuôi cấy của chủng Natto ở pH 7 Thời gian (h) OD/540nm Hàm lượng đường % ức chế 0 6 12 18 24 30 36 42 1,402 1,033 0,828 0,491 0,569 0,688 0,449 1,351 0,285 0,209 0,166 0,097 0,113 0,137 0,088 0,274 8,00% 33,13% 47,09% 70,05% 64,73% 56,63% 72,91% 11,47% Bảng P - 12: Khảo sát khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase từ canh trường nuôi cấy của chủng Natto ở pH 8 Thời gian (h) OD/540nm Hàm lượng đường % ức chế 0 6 12 18 24 30 36 42 1,349 1,286 1,170 0,737 0,692 0,466 1,065 0,700 0,274 0,261 0,237 0,148 0,138 0,092 0,215 0,140 11,61% 15,90% 23,80% 53,29% 56,36% 71,75% 30,95% 55,81% Nguyễn Quỳnh Trang – KS.CNSH 07 – 01 52 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Bảng P - 13: Khảo sát khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase từ canh trường nuôi cấy của chủng Natto ở pH 9 Thời gian (h) OD/540nm Hàm lượng đường % ức chế 0 6 12 18 24 30 36 42 1,425 1,002 0,621 0,883 0,473 0,470 0,798 0,897 0,290 0,202 0,124 0,178 0,093 0,092 0,160 0,181 6,43% 35,24% 61,19% 43,35% 71,27% 71,48% 49,14% 42,39% IV.3.Nồng độ cơ chất  Kết quả khảo sát hoạt tính ức chế α-glucosidase từ chủng Natto sử dụng các cơ chất khác nhau với hàm lượng Nitơ tổng 1,5%. Bảng P - 14: Khảo sát khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase từ canh trường nuôi cấy của chủng Natto sử dụng cơ chất đậu đen Thời gian (h) 0 6 12 18 24 30 36 42 OD/540n m 1,318 1,058 1,007 0,852 0,673 0,626 0,774 0,856 Hàm lượng đường % ức chế 0,267 0,214 0,203 0,171 0,134 0,125 0,155 0,172 20,49% 37,26% 40,55% 50,54% 62,09% 65,12% 55,57% 50,29% Nguyễn Quỳnh Trang – KS.CNSH 07 – 01 53 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Bảng P - 15: Khảo sát khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase từ canh trường nuôi cấy của chủng Natto sử dụng cơ chất đậu xanh Thời gian (h) OD/540nm 0 6 12 18 24 30 36 42 1,242 1,105 0,965 0,834 0,658 0,574 0,963 0,979 Hàm lượng đường % ức chế 0,252 0,223 0,195 0,168 0,131 0,114 0,194 0,197 25,39% 34,23% 43,26% 51,71% 63,05% 68,47% 43,39% 42,35% Bảng P - 16: Khảo sát khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase từ canh trường nuôi cấy của chủng Natto sử dụng cơ chất đậu tương Thời gian (h) OD/540nm Hàm lượng đường % ức chế 0 6 12 18 24 30 36 42 1,216 1,.048 0,875 0,803 0,615 0,541 0,721 0,978 0,246 0,212 0,176 0,161 0,122 0,107 0,144 0,197 27,07% 37,90% 49,06% 53,70% 65,83% 70,60% 58,99% 42,42%  Kết quả tối ưu hoạt tính ức chế α-glucosidase từ chủng Natto sử dụng cơ chất đậu tương. Bảng P - 17: Khảo sát khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase từ canh trường nuôi cấy của chủng Natto với hàm lượng Nitơ tổng 0% Nguyễn Quỳnh Trang – KS.CNSH 07 – 01 54 Khóa luận tốt nghiệp Thời gian (h) Viện Đại học Mở Hà Nội OD/540nm Hàm lượng đường % ức chế 0 1,501 0,305 8,69% 6 1,496 0,304 9,01% 12 1,422 0,289 13,79% 18 1,435 0,292 12,95% 24 1,389 0,282 15,91% 30 1,356 0,275 18,04% 36 1,475 0,300 10,37% 42 1,484 0,302 9,79% Bảng P - 18: Khảo sát khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase từ canh trường nuôi cấy của chủng Natto với hàm lượng Nitơ tổng 1% Thời gian (h) OD/540nm 0 6 12 18 24 30 36 42 Hàm lượng đường % ức chế 0,245 0,219 0,189 0,176 0,163 0,131 0,181 0,230 27,59% 35,65% 45,00% 48,93% 52,99% 62,99% 47,64% 32,10% 1,208 1,083 0,938 0,877 0,814 0,659 0,897 1,138 Bảng P - 19: Khảo sát khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase từ canh trường nuôi cấy của chủng Natto với hàm lượng Nitơ tổng 2% Thời gian (h) OD/540nm 0 6 Hàm lượng đường % ức chế 0,242 0,214 28,49% 37,32% 1,194 1,057 Nguyễn Quỳnh Trang – KS.CNSH 07 – 01 55 Khóa luận tốt nghiệp 12 18 24 30 36 42 Viện Đại học Mở Hà Nội 0,963 0,784 0,685 0,527 0,725 1,011 0,194 0,157 0,137 0,104 0,145 0,204 43,39% 54,93% 61,31% 71,50% 58,73% 40,29% Bảng P - 20: Khảo sát khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase từ canh trường nuôi cấy của chủng Natto với hàm lượng Nitơ tổng 5% Thời gian (h) 0 6 12 18 24 30 36 42 OD/540nm Hàm lượng đường 1,116 1,013 0,915 0,793 0,575 0,306 0,963 0,996 0,226 0,204 0,184 0,159 0,114 0,059 0,194 0,201 % ức chế 33,52% 40,16% 46,48% 54,35% 68,41% 85,75% 43,39% 41,26% Bảng P - 21: Khảo sát khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase từ canh trường nuôi cấy của chủng Natto với hàm lượng Nitơ tổng 10% Thời gian (h) 0 6 12 18 24 30 36 42 OD/540nm Hàm lượng đường 1,178 0,989 0,946 0,804 0,657 0,626 0,831 1,252 Nguyễn Quỳnh Trang – KS.CNSH 07 – 01 0,239 0,200 0,191 0,161 0,131 0,125 0,167 0,254 % ức chế 29,52% 41,71% 44,48% 53,64% 63,12% 65,12% 51,90% 24,75% 56 [...]... được dịch thủy phân 1 + Phản ứng DNS: 250μl dịch thủy phân 1 + 750μl nước cất + 1ml dung dịch DNS đun sôi trong 10 phút sau đó làm nguội dưới vòi nước lạnh và đem đo OD ở bước sóng 540nm Xây dựng đường chuẩn glucose có phương trình: y = ax + b Dựa vào phương trình đường chuẩn glucose, ta xác định được hàm lượng đường tạo thành trong dịch thủy phân 1 là A (mg/ml) Từ đó ta có công thức tính hàm lượng đường. .. tiểu đường [54] Tinh bột hoặc đường (sucrose) có thành phần quan trọng là carbonhydrate và là một cấu tử gồm kết hợp của hai hoặc nhiều loại đường (glucose hoặc fructose) Trong cơ thể chúng ta hầu như không thể hấp thu trực tiếp được các loại carbonhydrate đó Vì vậy các loại carbonhydrate đó (di, oligo, poly saccharide) đó phải được thủy phân hoàn toàn bởi các loại enzyme tiêu hóa để các saccharide... lấy dịch ở bên trên) lắc đều giữ phản ứng ở 37ºC trong bóng tối 30 phút, sau đó đun sôi trong 5 phút để dừng phản ứng ta thu được dịch thủy phân 2 + Phản ứng DNS: 250μl dịch thủy phân 2 + 750μl nước cất + 1ml dung dịch DNS đun sôi trong 10 phút sau đó làm nguội dưới vòi nước lạnh và dem đo OD ở bước sóng 540nm Dựa vào phương trình đường chuẩn glucose ta xác định được hàm lượng đường tạo thành trong dịch. .. công thức (*) : Phản ứng DNS: 250μl dịch canh trường nuôi cấy vi khuẩn + 750μl nước cất + 1ml dung dịch DNS đun sôi trong 10 phút sau đó làm nguội dưới vòi nước lạnh và đem đo OD ở bước sóng 540nm Dựa vào phương trình đường chuẩn glucose ta xác định được hàm lượng đường tạo thành trong dịch canh trường nuôi cấy vi khuẩn là C (mg/ml) 2.2.7 Xây dựng đường cong sinh trưởng của các chủng Bacillus subtilis... [10] Trên thế giới hiện nay vẫn và đang nghiên cứu rất nhiều loại thuốc hay thực phẩm chức năng có chứa AGIs để hỗ trợ cho phòng và chữa bệnh tiểu đường 1.5.3.2 Ở Việt Nam Ở Việt Nam hiện nay tỉ lệ người mắc bệnh tiểu đường ngày càng gia tăng Tuy nhiên, việc sản xuất thuốc chữa theo hướng ức chế α-glucosidase vẫn chưa có bất kì sản phẩm nào Những loại thuốc hay thực phẩm chức năng có chứa AGIs trên... hoàn toàn từ nước ngoài Các loại thuốc chữa trị tiểu đường ở Việt Nam đa phần là thuốc đông y chiết xuất từ một số loại cây thuốc có tác dụng giảm đường huyết như: dây thìa canh, giảo cổ lam, … Hiện nay, Việt Nam đang tiến hành nghiên cứu khảo sát hoạt tính ức chế α-glucosidase từ nấm mốc, vi khuẩn và cây lá sữa … để ứng dụng trong điều trị tiểu đường Nguyễn Quỳnh Trang – KS.CNSH 07 – 01 15 Khóa luận... trưởng nồng độ đường trong máu hơn cả Acarbose [25] Việc nghiên cứu và sản xuất các chất ức chế α-glucosidase hiện nay đã đang và vẫn được các nhà khoa học chú ý Đặc biện chú ý hơn là các nguồn nguyên liệu tự nhiên và sẵn có Nguyễn Quỳnh Trang – KS.CNSH 07 – 01 12 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội 1.5.2 Cơ chế tác dụng của AGIs trong điều trị tiểu đường type 2 Hình 5: Cơ chế tác dụng của AGIs trong... ruột [23] Hai chất Salacinol và Kotalanol đã được các nhà khoa học Nhật Bản nghiên cứu và nhận thấy đó là chất có thành phần có khả năng ức chế αglucosidase được lấy từ dung dịch nước hòa tan với rễ và thân cây Salacia reticulata [24,25] Nguyễn Quỳnh Trang – KS.CNSH 07 – 01 11 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Hình 4: Cấu trúc hóa học của Salacinol và Kotalanol [10] Giá trị IC50 của Salacinol... amylase trong nước bọt chuyển hóa thành maltose (sự kết hợp của hai phân tử glucose) Đường sucrose và maltose sẽ bị một loại enzyme có tên là α-glucosidase sẽ thủy phân các saccharide thành các D-glucose mà cơ thể hấp thu được ở niêm mạc ruột Các chất ức chế enzyme có đặc tính ức chế hoạt động của α-glucosidase Nói cách khác, nhờ sự hiện diện của các chất ức chế thì glucose và Nguyễn Quỳnh Trang – KS.CNSH... chặt chẽ vào nhiệt độ Nên yếu tố nhiệt độ, rõ ràng ảnh hưởng sâu sắc đến các quá trình sống của tế bào Và mỗi loài vi khuẩn có nhiệt độ phát triển tối thích khác nhau Xác định nhiệt độ tại đó vi khuẩn tăng trưởng nhanh, phát triển mạnh và cho hoạt tính cao * Tiến hành: Trong nghiên cứu này, nhiệt độ thích hợp của Bacillus subtilis được xác định bằng cách nuôi vi khuẩn trong môi trường LB lỏng ở các ... tiểu đường xét nghiệm đường máu lúc đói nồng độ đường có giá trị lớn 7,8mmol/l; thời gian gần tổ chức y tế giới đưa khuyến cáo số đường máu lớn 7mmol/l chẩn đoán đái tháo đường Bởi vì, lượng đường. .. Acarbose chỗ gần hấp thụ hoàn toàn đường ruột có hiệu ứng tác động lên hệ thống tiếp giáp với đường ruột [23] Hai chất Salacinol Kotalanol nhà khoa học Nhật Bản nghiên cứu nhận thấy chất có thành phần... hưởng nhỏ lên dày [10] Trên giới nghiên cứu nhiều loại thuốc hay thực phẩm chức có chứa AGIs để hỗ trợ cho phòng chữa bệnh tiểu đường 1.5.3.2 Ở Việt Nam Ở Việt Nam tỉ lệ người mắc bệnh tiểu đường