Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Ngô Đăng Nghĩa & TS. Đặng Thúy Bình SVTH: Lê Thị Bích Hảo – Lớp 49SH L L ờ ờ i i c c ả ả m m ơ ơ n n Trong quá trình học tập và nghiên cứu đề tài tại trường Đại học Nha Trang em nhận được sự quan tâm của cơ quan, nhà trường, sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô giáo, bạn bè và người thân. Em xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo của trường Đại học Nha Trang, thầy cô giáo cán bộ Viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường đã truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong những năm học vừa qua. Với tình cảm chân thành và lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS. Ngô Đăng Nghĩa và TS. Đặng Thúy Bình đã tận tình quan tâm hướng dẫn và chỉ bảo giúp em hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp này. Em xin cảm ơn Ths. Trương Thị Thu Thủy, cán bộ tổ Nghiên cứu Triển khai công nghệ, cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ phòng thí nghiệm: Bộ môn Công Nghệ Sinh học, bộ môn Môi Trường thuộc Viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường trường Đại học Nha Trang giúp đỡ em hoàn thành tốt luận văn này. Em xin chân thành cảm ơn sự quan tâm, giúp đỡ động viên của gia đình, bạn bè, người thân, cảm ơn những ý kiến đóng góp và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Vì kiến thức và thời gian có hạn nên luận văn tốt nghiệp của em không sao tránh khỏi những thiếu sót, em rất mong được sự góp ý của các thầy cô giáo để luận văn của em hoàn thiện hơn và đạt kết quả cao nhất. Em xin chân thành cảm ơn! Cuối cùng, em xin kính chúc mọi người dồi dào sức khỏe và thành công! Nha Trang ngày 07 tháng 07 năm 2011 Sinh viên Lê Thị Bích Hảo Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Ngô Đăng Nghĩa & TS. Đặng Thúy Bình SVTH: Lê Thị Bích Hảo – Lớp 49SH M M Ụ Ụ C C L L Ụ Ụ C C T T r r a a n n g g MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU I.1. TỔNG QUAN VỀ VÙNG NGHIÊN CỨU 4 I.1.1. Đặc điểm điều kiện tự nhiên và sinh thái môi trường đảo Cù Lao Chàm 4 I.1.2. Đặc điểm điều kiện tự nhiên và sinh thái môi trường huyện đảo Lý Sơn 5 I.1.3. Đặc điểm điều kiện tự nhiên và sinh thái môi trường thị xã Sông Cầu 5 I.1.4. Đặc điểm điều kiện tự nhiên và sinh thái môi trường vịnh Vân Phong 7 I.2. TỔNG QUAN VỀ ỐC CỐI VÀ ĐỘC TỐ ỐC CỐI (CONUS SPP.) 9 I.2.1. Tổng quan ốc cối 9 I.2.1.1. Đặc điểm sinh thái và phân bố 9 I.2.1.2. Đặc điểm hình thái bên ngoài và cấu tạo bên trong của ốc cối 13 I.2.1.3. Đặc điểm sinh học và sinh sản 17 I.2.2. Tổng quan độc tố ốc cối 18 I.2.2.1. Giới thiệu về độc tố ốc cối 18 I.2.2.2. Cấu tạo bộ máy sinh độc tố 19 I.2.2.3. Phân loại độc tố conotoxin 22 I.2.2.4. Ứng dụng y học của độc tố ốc cối 24 I.3. TỔNG QUAN VỀ TY THỂ VÀ DNA TY THỂ 26 I.4. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DI TRUYỀN ỐC CỐI (CONUS SPP.) 32 I.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 32 I.4.1.1. Nghiên cứu mối quan hệ tiến hóa và phát sinh chủng loài của ốc cối 32 I.4.1.2. Nghiên cứu di truyền độc tố 35 I.4.1.3. Nghiên cứu di truyền quần thể ốc cối 36 I.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước 36 CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU II.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU VÀ ĐỊA ĐIỂM THU MẪU 39 Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Ngô Đăng Nghĩa & TS. Đặng Thúy Bình SVTH: Lê Thị Bích Hảo – Lớp 49SH II.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40 II.2.1. Phương pháp phân loại dựa trên đặc điểm hình thái ốc cối 42 II.2.2. Tách chiết DNA các loài ốc cối 44 II.2.3. Phản ứng khuếch đại 46 II.2.4. Giải và phân tích trình tự 48 II.2.5. Xử lý số liệu xây dựng cây phát sinh loài 48 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN III.1. ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI ỐC CỐI 53 III.2. NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN ỐC CỐI 59 III.2.1. Kiểm tra DNA tổng số 59 III.2.2. Khuếch đại gen 59 _Toc298320803 III.2.3. Đa dạng di truyền DNA ốc cối 60 III.2.4. Xây dựng cây phát sinh loài dựa trên gen CO1 mt DNA 61 III.3. THẢO LUẬN 67 III.3.1. Mối quan hệ loài ốc cối dựa trên chỉ thị phân tử CO1 mtDNA 67 III.3.2. Mối quan hệ giữa loài và chế độ dinh dưỡng 69 III.3.3. Sự khác biệt di truyền giữa các trình tự 71 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ Ý KIẾN ĐỀ XUẤT IV.1. KẾT LUẬN 73 IV.2. Ý KIẾN ĐỀ XUẤT 74 TÀI LIỆU THAM KHẢO 75 Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Ngô Đăng Nghĩa & TS. Đặng Thúy Bình SVTH: Lê Thị Bích Hảo – Lớp 49SH D D A A N N H H M M Ụ Ụ C C C C Á Á C C B B Ả Ả N N G G Bảng 1.1: Đặc điểm phân bố, sinh thái và kích cỡ trung bình của một số loài ốc phổ biến ở biển Việt Nam 11 Bảng 1.2: Các superfamily của conotoxin (Bingham, 2010) 24 Bảng 1.3: Các peptide độc tố với những liệu pháp tiềm năng 26 Bảng 1.4: Các genome ty thể có các gen mã hóa cho các protein, rRNA và tRNA 30 Bảng 2.1: Thông số dùng để phân loại kích cỡ chiều dài của ốc theo Verlag Christa Hemmen (1995) 43 Bảng 2.2: Công thức được dùng để phân loại trọng lượng của các loài ốc theo Verlag Christa Hemmen (1995) 43 Bảng 2.3: Công thức dùng để phân loại hình thái của ốc cối theo Verlag Christa Hemmen (1995) 43 Bảng 2.4: Công thức dùng để phân loại kích cỡ của ốc cối theo Verlag Christa Hemmen (1995) 44 Bảng 2.5: Các thông số của quá trình phân tích các trình tự và mô hình tiến hóa 49 Bảng 2.6: Trình tự gen CO1 mtDNA và chế độ ăn của các loài ốc cối 50 Bảng 3.1: Kích thước, khối lượng, đường kính của một số loài ốc cối 57 Bảng 3.2: Bảng giá trị tính theo công thức chuẩn quốc tế của một số loài ốc cối 58 Bảng 3.3:Kết quả sự khác biệt di truyền giữa các trình tự 60 Bảng 3.4: Các nhóm loài ốc cối trên cây phân loại từ các phương pháp MP, ML và BI. 64 Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Ngô Đăng Nghĩa & TS. Đặng Thúy Bình SVTH: Lê Thị Bích Hảo – Lớp 49SH D D A A N N H H M M Ụ Ụ C C C C Á Á C C H H Ì Ì N N H H Hình 1.1: Bản đồ phân bố ốc cối Conus trên thế giới 10 Hình 1.2: Các thông số hình thái vỏ của ốc cối (Conus spp.) 13 Hình 1.3: Các dạng hình thái vỏ khác nhau của ốc cối (Conus spp.) 14 Hình 1.4: Cấu tạo bên trong của ốc cối 14 Hình 1.5: Phương thức săn mồi theo dạng móc câu của ốc cối 16 Hình 1.6: Phương thức bắt mồi dạng lưới của ốc cối 16 Hình 1.7: Vòng đời của ốc cối (Conus spp.) (Rockel và cs, 1995) 18 Hình 1.8: Cấu tạo tuyến nọc độc của ốc cối. (Olivera, 2002, có bổ sung) 20 Hình 1.9: Răng kitin Conus spp. 21 Hình 1.10: Cấu trúc của ty thể 26 Hình 1.11: DNA ty thể người, bao gồm 22 gen tRNA, 2 gen rRNA, và 13 vùng mã hóa protein 28 Hình 1.12: Cấu trúc hệ gen ty thể của Conus textile 31 Hình 2.1: Địa điểm thu mẫu (Cù Lao Chàm, Lý Sơn, Sông Cầu, Vân Phong). 40 Hình 2.2: Sơ đồ phương pháp nghiên cứu 41 Hình 2.3: Cấu tạo bên ngoài của ốc cối 42 Hình 2.4: Chương trình nhiệt độ của phản ứng khuếch đại 47 Hình 2.5: Chương trình nhiệt độ của phản ứng tiền giải trình tự 48 Hình 3.1: Hình thái vỏ của các loài ốc cối phân bố ở vùng biển Việt Nam 53 Hình 3.2: Kết quả điện di DNA tổng số của các mẫu ốc cối 59 Hình 3.3: Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen CO1 mtDNA của các mẫu ốc cối.60 Hình 3.4: Cây phát sinh loài dựa trên gen CO1 mtDNA của ốc cối thu tại vùng biển Nam Trung Bộ, Việt Nam 62 Hình 3.5: Cây phát sinh loài theo phương pháp Baysian Inference (BI) dựa trên gen CO1 mtDNA của ốc cối thu tại vùng biển Nam Trung Bộ, Việt Nam 63 Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Ngô Đăng Nghĩa & TS. Đặng Thúy Bình SVTH: Lê Thị Bích Hảo – Lớp 49SH DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT CO1 Cytochrome c oxydase subuint 1 DNA Deoxyribonucleic acid RNA Ribonucleic acid mtDNA (mitochondrial DNA) DNA ty thể 16S rDNA 16S ribosomal DNA PCR Polymerase Chain Reaction L (Shell Length) Chiều dài của ốc (mm) PMD (Position of Maximum Diameter of last whorl) Vị trí của đường kính lớn nhất tương đối của ốc cối ở cuối vòng xoắn. RD (Relative Diameter of last whorl) Đường kính lớn nhất tương đối của ốc cối RSH (Relative Spire Height, as proportion of shell length) Chiều cao tương đối của tháp vỏ RW (Relative Weight of shell) Trọng lượng tương đối của ốc cối Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Ngô Đăng Nghĩa & TS. Đặng Thúy Bình 1 SVTH: Lê Thị Bích Hảo – Lớp 49SH MỞ ĐẦU Thực tế hiện nay cho thấy đa dạng sinh học đang bị suy thoái với tốc độ rất nhanh. Bằng các hoạt động của mình, con người đã gây mất hàng loạt các khu rừng nguyên sinh, các vùng đất ngập nước qua đó đã làm gia tăng tốc độ tuyệt chủng của các loài gấp 1.000 lần so với tỷ lệ tự nhiên. Số loài và số lượng cá thể của các loài hoang dã bị suy giảm mạnh. Các nguồn gen hoang dã cũng đang trên đà suy thoái nhanh và thất thoát. Bờ biển Việt Nam dài 3260 km và có hơn 3000 đảo lớn nhỏ. Việt Nam có tiềm năng về kinh tế biển với khoảng 20 hệ sinh thái biển, trong đó có hơn khoảng 11000 loài bao gồm 2500 loài cá biển, 225 loài tôm, hơn 200 loài thủy sinh vật, gần 700 loài động vật nổi và 100 loài thực vật rừng ngập mặn, 15 loài cỏ biển và hơn 6000 loài động vật không xương sống. Theo ước tính có khoảng 1122 km 2 rạn san hô phân bố từ Bắc vào Nam, 90% các loài san hô cứng ở vùng biển Ấn Độ- Thái Bình Dương được tìm thấy ở Việt Nam (http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/tai-nguyen- he-sinh-thai-bien-viet-nam.514937.html). Ở nước ta, ốc là một trong những nhóm nguồn lợi hải sản quan trọng, có mức độ phong phú về thành phần loài, trong đó có nhiều loài có giá trị thương mại cao như ốc Tù Và, ốc Hương, ốc Bàn Tay, ốc Cối. Trong số đó có thể kể đến ốc Cối, là một trong những họ động vật thân mềm lớn thuộc loài ăn thịt và có nọc độc. Các loài ốc Cối có giá trị kinh tế cao do vỏ của chúng có màu sắc và hoa văn đẹp nên thường được khai thác để làm đồ trang sức, mỹ nghệ và các vật phẩm lưu niệm. Ngoài ra, ốc Cối còn là nguồn nguyên liệu sản xuất "thần dược" chữa các cơn đau mãn tính, ung thư và nhiều bệnh khác. Vì những lợi ích về kinh tế và y học đó mà tình trạng khai thác bừa bãi các loài ốc Cối ngày càng gia tăng. Bởi vậy, đòi hỏi chúng ta phải có các nghiên cứu để bảo tồn một cách hợp lý và đúng đắn nguồn tài nguyên này. Các nghiên cứu về ốc Cối ở nước ta cho tới nay mới chỉ được thực hiện ở mức độ khảo sát, thu thập mẫu và tư liệu liên quan; xác định độc tính và kiểm chứng tính chất của một số độc tố (http://www.vnio.org.vn/ ). Hiện nay các nghiên Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Ngô Đăng Nghĩa & TS. Đặng Thúy Bình 2 SVTH: Lê Thị Bích Hảo – Lớp 49SH cứu phát sinh chủng loại nào về ốc Cối Việt Nam tiến hành ở mức độ phân tử còn nhiều hạn chế. Vì vậy, nghiên cứu và xây dựng phát sinh chủng loại các loài ốc cối Việt Nam bằng các phương pháp sinh học phân tử là rất cần thiết, nó sẽ góp phần vào công tác bảo tồn và lưu giữ nguồn gen ốc Cối Việt Nam. Vì những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu mối quan hệ loài của ốc cối (Conus spp.) ở vùng biển Nam Trung Bộ Việt Nam dựa trên chỉ thị phân tử gen CO1 của DNA ty thể (CO1 mtDNA)”. Dựa trên việc nghiên cứu mối quan hệ giữa các loài này ta tiến hành điều tra để đánh giá hiện trạng nguồn lợi ốc cối ở vùng biển Việt Nam. Đây là vấn đề rất cần thiết vì bước đầu tạo cơ sở dữ liệu đầu vào cần thiết cho việc tính toán, đề xuất các biện pháp quản lý và sử dụng hợp lý nguồn lợi ốc cối ở vùng biển Việt Nam.  MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI:  Khảo sát và đánh giá đặc điểm di truyền của loài ốc cối (Conus spp.).  Bước đầu khảo sát mối quan hệ tiến hóa giữa các loài ốc Conus thu được vùng biển Nam Trung Bộ Việt Nam dựa trên phân tích giải trình tự gen CO1 của DNA ti thể (Mitochondrial DNA).  NỘI DUNG CHÍNH CỦA ĐỀ TÀI:  Nghiên cứu mối quan hệ loài của các loài ốc cối (Conus spp.) ở vùng biển Nam Trung Bộ Việt Nam dựa trên chỉ thị phân tử gen CO1 của DNA ty thể (CO1 mtDNA).  Xây dựng cây phát sinh loài của các loài ốc cối ở vùng biển Nam Trung Bộ Việt Nam. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Ngô Đăng Nghĩa & TS. Đặng Thúy Bình 3 SVTH: Lê Thị Bích Hảo – Lớp 49SH CHƯƠNG I T T Ổ Ổ N N G G Q Q U U A A N N T T À À I I L L I I Ệ Ệ U U Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Ngô Đăng Nghĩa & TS. Đặng Thúy Bình 4 SVTH: Lê Thị Bích Hảo – Lớp 49SH I.1. TỔNG QUAN VỀ VÙNG NGHIÊN CỨU I.1.1. Đặc điểm điều kiện tự nhiên và sinh thái môi trường đảo Cù Lao Chàm Quảng Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới, chỉ có 2 mùa là mùa mưa và mùa khô, chịu ảnh hưởng của mùa đông lạnh miền Bắc. Nhiệt độ trung bình năm 20-21 o C, không có sự cách biệt lớn giữa các tháng trong năm. Lượng mưa trung bình 2000-2500mm, nhưng phấn bố không đều theo thời gian và không gian, mưa ở miền núi nhiều hơn đồng bằng. Nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa hải đảo nên nhiệt độ nước biển cũng chịu ảnh hưởng của nhiệt độ không khí. Nhiệt độ nước biển dao động trong khoảng từ 22,5 – 30,5 o C. Hàm lượng vật lơ lửng ở ven bờ Quảng Nam thường giao động trong khoảng 0,2 – 1,2mg/l , đặc biệt cực trị hàm lượng vật lơ lửng cao (3,5mg/l) xảy ra vào tháng 1 năm 2008. Cù Lao Chàm là một cụm đảo xã đảo Tân Hiệp, thành phố Hội An, tỉnh Quảng Nam, nằm cách bờ biển Cửa Đại 15km. Cù Lao Chàm bao gồm 8 đảo: Hòn Lao, Hòn Dài, Hòn Mồ, Hòn Khô mẹ, Hòn Khô con, Hòn Lá, Hòn Tai, Hòn Ông. Do địa thế các đảo chụm lại với nhau tạo thành vịnh kín, đồng thời là bức tường bảo vệ các rạn san hô, nhờ thế mà nơi đây tạo thành hệ sinh thái, và còn là nơi trú ngụ của nhiều loài ốc như ốc đụn, ốc cối. Phân bố của các hệ sinh thái khu vực Cù Lao Chàm Các rạn san hô phân bố chủ yếu ở phía Tây và Tây Nam đảo Hòn Lao và xung quanh các đảo nhỏ với tổng diện tích khoảng 165ha. Các rạn san hô này phát triển tốt với các loài ưu thế thuộc các chi Acropora, Montipora và Goniopora. Vùng phía Bắc và phía Đông đảo chính Cù Lao Chàm, chủ yếu là rạn đá dốc đứng, các nguồn lợi sinh vật khó tồn tại và phát triển ở khu vực này. Vùng phía Nam của Cù Lao Chàm, xen kẽ giữa các rạn san hô là các bãi cát và thảm cỏ biển phát triển. Diện tích các bãi cát và thảm cỏ biển được ước tính lên đến 75 ha. Hải sâm cũng có thể phân bố ở khu vực này. [...]... lo i Prôtêin (các enzim ôxi ho ) + T o ra nhi u s n ph m trung gian có vai trò trong quá trình chuy n hoá v t ch t H gen ti th (Mitochondrial DNA – mtDNA) (Hình 1.1 1) DNA ty th (mitochondrial DNA- mtDNA) là m t genome m ch vòng, ư c c l p, thư ng là nh v trong ty th B gen ty th có c u t o xo n kép, tr n, m ch vòng v i 2 ch c năng ch y u: - Mã hóa nhi u thành ph n c a ty th - Mã hóa cho m t s protein... phân t ti u genome (subgenome) m ch vòng nh hơn, cùng t n t i v i genome “ch ” (master genome) hoàn ch nh, ã gi i thích cho s ph c t p c a các DNA ty th th c v t B ng 1.4 tóm t t s phân công c a các gen trong m t s genome ty th T ng s gen mã hóa protein là khá ít, và không tương quan v i kích thư c c a genome Ty th ng v t có vú s d ng các genome 16 kb c a chúng mã hóa cho 13 protein, trong khi ó ty. .. ng p m n, ho c s ng vùng nư c sâu n 400m (Rockel và cs, 199 5) * Phân b Gi ng c c i phân b kh p nơi trên th gi i, chúng thư ng phân b gi a 400 B c và 400 Nam, tương ương v i các vùng bi n: n Dương, Panamic, Caribbean, Peru, Patagonic, Tây và Nam Phi và M t s loài có th phân b vĩ trên 400 như SVTH: Lê Th Bích H o – L p 49SH vùng vĩ - Thái Bình a Trung H i Nam Phi, Nam Australia, Nam án t t nghi p GVHD:... (http://128.192.10.160/mp/20m?kind=Conus) T i Vi t Nam, c c i phân b ch y u Nam Trung B t Hoàng Sa, Côn à N ng các vùng ven bi n thu c khu v c n Kiên Giang và quanh các h i o (như Trư ng Sa, o) v i kho ng 76 loài (Hylleberg và Kilburm, 200 3) Hylleberg, và Kilburm (200 3) trong khuôn kh d án Tropical Marine Molluscs Program (TMMP) ã công b 76 loài c c i ư c tìm th y Vi t Nam M t s loài c c i ph bi n Vi t Nam như c c i nâu (C vexilum), c... kho ng 22 ty th trên m t t bào, tương ng kho ng 4 genome trên m t cơ quan t nh ng t bào sinh trư ng, t l mtDNA có th cao hơn (kho ng 18 %) Kích thư c c a genome ty th các loài th c v t là r t khác nhau, t i thi u kho ng 100 kb Kích thư c l n c a genome ã gây khó khăn cho vi c phân l p nguyên v n DNA, nhưng b n c t h n ch (restriction map) trong m t vài loài th c v t ã cho th y genome ty th thư ng là... Các genome ty th có kích thư c t ng s r t khác nhau, các t bào kích thư c genome nh (kho ng 16,5 kb ng v t có ng v t có v ) Có kho ng m t vài trăm ty th trên m t t bào M i ty th có nhi u b n sao DNA S lư ng t ng s c a DNA ty th so v i DNA nhân là r t nh ( . cứu mối quan hệ loài của ốc cối (Conus spp. ) ở vùng biển Nam Trung Bộ Việt Nam dựa trên chỉ thị phân tử gen CO1 của DNA ty thể (CO1 mtDNA) . Dựa trên việc nghiên cứu mối quan hệ giữa các loài. cối (Conus spp. ) ở vùng biển Nam Trung Bộ Việt Nam dựa trên chỉ thị phân tử gen CO1 của DNA ty thể (CO1 mtDNA).  Xây dựng cây phát sinh loài của các loài ốc cối ở vùng biển Nam Trung Bộ Việt. được vùng biển Nam Trung Bộ Việt Nam dựa trên phân tích giải trình tự gen CO1 của DNA ti thể (Mitochondrial DNA) .  NỘI DUNG CHÍNH CỦA ĐỀ TÀI:  Nghiên cứu mối quan hệ loài của các loài ốc cối