bài tiểu luận đề tài nuôi cấy mô tế bào thực vật

- 1941, Overbeek và Cs đã sử dụng nước dừa trong nuôi cấy phôi non ở cây cà rốt Datura -1952, Morel và Martin đã tạo ra cây sạch bệnh virus của 6 giống khoai tây từ nuôi cấy đỉnh sinh tr

TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦY L I ỢKHOA HÓA VÀ MÔI TRƯỜNG

Môn: Nh p môn CNSH ậGiáo viên hướng dẫn:

Hà Nội, tháng 6 năm 2023

3.Điều ki n nuôi c y mô t bào th c v t ệ ấ ế ự ậ 7

4 Nuôi cấy mô và nhân gi ng in vitro ố 9

4.1 Nhân gi ng in vitro ố 9

4.2 Các phương pháp nhân giống in vitro 10

4.3 Các giai đoạn trong quá trình nhân gi ng in vitro ố 18

5 K thu t chuy n gen trong nuôi c y mô t bào ỹ ậ ể ấ ế 20

5.1 Chuy n gen gián ti p thông qua Agrobacterium ể ế 20

5.2 Các gen ch ỉ thị chọ ọn l c và gen ch sàng l c ỉ thị ọ 21

5.3 Chuy n gen bể ằng vi đạn 22

5.4 Công ngh di truy n trong kháng ch t di t c ệ ề ấ ệ ỏ 22

5.5 Công ngh di truy n trong kháng sâu b nh ệ ề ệ 23

3

8.Kết luận 33 Tài li u tham khệ ảo 34

1 M u ở đầ1.1 Nêu vấn đề

Trong những năm gần đây, sản lượng các thực vật bậc cao rất khó đảm bảo ở mức ổn định do điều kiện tự nhiên không thu n lậ ợi, chi phí lao động ngày càng tăng, các khó khăn về kỹ thuật và kinh t trong tr ng trế ồ ọt…Phương pháp nuôi cấy t bào d ch huy n phù th c v t trong bioreactor có kh ế ị ề ự ậ ả năng góp phần giải quyết những khó khăn nói trên Hiện nay, nhi u h p chề ợ ất t nhiên dùng làm ựdược phẩm ho c ph gia th c phặ ụ ự ẩm đã đượ ảc s n xu t thành công bấ ằng phương thức nuôi c y t bào trên quy mô công nghi p cho hi u suấ ế ệ ệ ất rất cao Đặc biệt, việ ảc s n xu t các protein ngoại lai để điều trị bệnh trong h ấ ệ thống t bào thế ực vật đang được chú ý do chúng an toàn cho người hơn các protein có nguồn gốc từ t ế bào động v t, b i vì các ch t nhi m b n và virus th c v t không ph i là tác ậ ở ấ ễ ẩ ự ậ ảnhân gây b nh ệ ở người Ngoài ra, b ng các k thu t nuôi cằ ỹ ậ ấy trong điều ki n vô ệtrùng các b ộ phận tách r i cờ ủa cơ thể thực vật, người ta đã nhân giống in vitro thành công nhi u loài cây tr ng có giá tr ề ồ ị mà trước đây các phương thức nhân giống truy n th ng g p nhiề ố ặ ều khó khăn.Vì vậy, đối v i công ngh sinh h c thớ ệ ọ ực vật nói chung và nuôi c y mô t bào th c v t nói riêng ấ ế ự ậ trong đờ ống con người s i là vô cùng c n thi ầ ết.

1.2 L ch s hình thành ị ử

-Cuối TK XIX, con người thử tách tế bào thực vật ra nuôi K ỹ thuật nuôi cấy mô t bào th c vế ự ật đến những năm 1930-1940 m i có nh ng kớ ữ ết qu ả ban đầu và được hoàn thi n dệ ần đến nay

- S phát tri n cự ể ủa nuôi cấy mô t bào th c v t có th ế ự ậ ể chia thành 4 giai đoạn: • Giai đoạn I (1902-1930) :Th nghiử ệm ban đầu

5

- Haberland (1902) là người đầu tiên đề xuất phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào dựa trên thuyết tế bào của Schleiden Schwann –

- 1939, ba nhà khoa học Gautheret, Nobecourt, và White đã đồng thời nuôi cấy mô sẹo thành công trong thời gian dài từ mô thượng tầng (cambium) ở cà rốt và thuốc lá, mô sẹo, có khả năng sinh trưởng liên tục

- 1941, Overbeek và Cs đã sử dụng nước dừa trong nuôi cấy phôi non ở cây cà rốt Datura

-1952, Morel và Martin đã tạo ra cây sạch bệnh virus của 6 giống khoai tây từ

nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, lần đầu thực hiện vi ghép in vitro thành công

-1954 – 1955: Skoog phát hiện kinetin có tác dụng kích thích sự phân chia tế bào

- 1955, Miller và Cs đã phát minh cấu trúc và sinh tổng hợp của kinetin- một cytokinin đóng vai trò quan trọng trong phân bào và phân hóa chồi ở mô nuôi cấy

• Giai đoạn III(1957 - 1992 ):

- 1956: Skoog và Miller tìm hiểu ảnh hưởng của tỉ lệ auxin/cytokinin trong

môi trường nuôi cấy đến sự hình thành cơ quan và tạo được chồi từ lá cây thuốc lá

-1960: Bergman đã tái sinh tế bào đơn thuốc lá trong môi trường lỏng - 1960: Cooking đã dung enzyme cellulase phân hủy vỏ cellulase của tế bào

thực vật thu được tế bào trần

-1964, Guha và Maheshwari lần đầu tiên thành công trong tạo được cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn của cây cà rốt Datura

- 1968: Nakata và Tanaka tạo được cây thuốc lá đơn bội bằng cách nuôi cấy bao phấn

-1971, Takebe và Cs đã tái sinh cây từ tế bào trần mô thịt lá (mesophill cell) ở thuốc lá

- Từ 1977: Melchers dung hợp tế bào trần giữa khoai tây và cà chua, thành công tạo ra cây lai khoai tây cà chua –

- Từ năm 1980: Hàng loạt nghiên cứu trong lĩnh vực công nghệ sinh học đã được công bố

• Giai đoạn IV: Ứng dụng các thành tựu vào sản xuất với quy mô lớn và trên diện rộng

2 Định nghĩa

- Nuôi c y mô t bào ấ ế thực v t là quá trình tách r i m t b ậ ờ ộ ộ phận c a th c v t, ủ ự ậnuôi trong môi trường dinh dưỡng phù hợp, ở đi u kiện vô trùng 100%, sau đó, ềmô t ế bào ban đầu sẽ phát triển thành cây hoàn thi n ệ

7

- Cơ sở ủa phương pháp nuôi cấy mô dựa trên tính toàn năng của tế bào T c ừmột t bào (hế ợp tử) ban đầu tr i qua quá trình nguyên phân liên t c t o ra các t ả ụ ạ ếbào m i Các t bào này có kh ớ ế ả năng tự phân chia đến một mức độ nhất định, chúng s phân hóa thành các b ẽ ộ phận chuyên biệt để thực hiện các ch c ứ năng khác nhau, nhưng vẫn mang đầy đủ các thông tin di truy n trong t ề ế bào ban đầu Khi tách riêng các t ế bào đã chuyên biệt để nuôi trong một môi trường với đầy đủ chất dinh dưỡng, các tế bào này có th ể hoạt hóa tr lở ại và phát tri n thành mô ểcơ quan, thậm chí là mô cơ thể

3 Điều kiện nuôi c y mô t bào th c v ấ ế ự ật

b Môi trường nuôi c y và các chấ ất điều hòa sinh trưởng

- Thành phần dinh dưỡng có thích hợp mới có thể hoạt hóa, kích thích gen bộ tếbào hoạt động, phân chia

- Tùy vào mục đích và đối tượng nuôi cấy, phải lựa chọn được môi trường phù hợp Từng giai đoạn phát triển khác nhau cũng có những loại môi trườngchuyên biệt

- Môi trường nuôi cấy phù hợp là môi trường có đầy đủ các thành phần dinh dưỡng bao gồm: Muối khoáng đa lượng, vilượng, các nguồn cacbon, acid amin

và chất điều hào sinh trưởng… Ngoài ra, tỉ lệ các chất cũng cầncânđối, chỉ nhưvậy mô tế bào mới có thể hoạt động, phân chia để tạo cây hoàn chỉnh

- Các chất điều hòa sinh trưởng có vai trò quan trọng trong các quá trình phân chia, biệt hóa bào Ngoài các tế ra, chất này còn có ảnh hưởng đến qua trình lão hóa mô và nhiều quá trình khác

+ Auxin: Thường dùng để kích thích sự phân chia bào, tế biệt hóa rễ, hình thành mô sẹo, kìm hãm sự phát triển chồ và tạo rễ phụ i

+ Cytokinin: Kích thích sự phân chia tế bào và quyết định sự phân hóa chồi bấtđịnh,môsẹo và cơ quan

+ Gibberellin: Kích thích sự nảy mầm của các loại hạt, kéo dài đốt, long, thân cành

+ Abscisic acid: Là chất ức chế sinh trưởng tự nhiên, khi được dung trong nuôi cấy mô tế bào thực avatj tác có dụng tương tác với nhóm chất khác giúp tang hệ số nhân chồi

+ Ethylen: Có tác động hai chiều Nó kìm hãm hình thành sự chồi ở giai đoạnsớm nhưng có tác dụng kích thích sự phát triển chồi ở giai đoạn muộn.Nó có tác dụng kích thích rễ ở một số trường hợp nhưng có tác dụng ngược lại ở mộtsố trường hợp khác

c Môi trường vật lý

- Ngoài môi trường nuôi cấy, các yếu tố môi trường vật lýcũng ảnh hưởng đếnquá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật :ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm,…

9

- Có những loài ưa sáng, có những loài lại ưa bóng râm thì cần được nuôi cấy trong điều kiện ánh sáng yếu Hay giai đoạn tạo chồi không cần nhiều sánh sáng như cây hoàn chỉnh,…

4 Nuôi c y mô và nhân gi ng in vitro ấ ố4.1 Nhân gi ng in vitro ố

- Nuôi c y mô (tissue culture) là thu t ng ấ ậ ữ dùng để chỉ quá trình nuôi cấy vô trùng in vitro các b ộ phận tách r i khác nhau c a th c v t ờ ủ ự ậ

- S d ng k thu t nuôi c y mô v i hai mử ụ ỹ ậ ấ ớ ục đích nhân giống và c i thi n di ả ệtruyền, sản xuất sinh kh i các s n ph m hóa sinh, b nh h c th c v t, duy trì và ố ả ẩ ệ ọ ự ậbảo qu n các nguả ồn gen quý…

- K thu t nuôi c y mô cho phép tái sinh ch i hoỹ ậ ấ ồ ặc cơ quan từ các mô như lá, thân, hoa ho c r ặ ễ

- Thu t ng nhân gi ng in vitro (in vitro propagation) hay còn g i là vi nhân ậ ữ ố ọgiống (micropropagation) được sử dụng đặc biệt cho việc ứng d ng các k ụ ỹthuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật, bắt đầu bằng nhiều bộ phận khác

nhau c a ủ thực vật có kích thước nhỏ, sinh trưởng ở điều kiện vô trùng trong các ống nghiệm ho c trong các lo i bình nuôi c y khác ặ ạ ấ

4.2 Các phương thức nhân giống in vitro

a.Nuôi cấy đỉnh phân sinh

- Phương thức nhân gi ng b ng cách dùng các ph n r t nh cố ằ ầ ấ ỏ ủa đỉnh chồi (shoot-tip) bao gồm mô phân sinh đỉnh riêng rẽ (single apical meristem) và mầm lá non (young leaf primordia) để kéo dài ch i (shoot elongation) ngay sau ồđó Kiểu nuôi cấy này được dùng lần đầu tiên để làm sạch virus (virus-free) ở thực vật Nếu dùng đỉnh phân sinh không thể s ng sót và t o rễ một cách độc ố ạlập, thì có th thay th bể ế ằng phương thức vi ghép (micrografting)

- Nếu độ ớ l n ch i nuôi cồ ấy tăng thì tỷ ệ ố l s ng và tính ổn định tăng, nếu độ ớn lgiảm thì t l s ng và tính ỷ ệ ố ổn định giảm

- Các phương thức phát triển cây hoành ch nh t ỉ ừ đỉnh sinh trưởng nuôi cấy:

Phát triển cây thông qua giai đoạn protocorm

- Chủ ế y u gặp ở các đối tượng m t lá mộ ầm (monocotyledon) như phong lan, dứa, huệ… Cùng một lúc đỉnh sinh trưởng t o hàng lo t protocorm (proembryo) ạ ạvà các protocorm này có thể tiếp t c phân chia thành các protocorm m i hoụ ớ ặc phát tri n thành cây hoàn ch nh Bể ỉ ằng phương thức này trong m t th i gian ộ ờngắn người ta có th ể thu được hàng tri u cá ệ thể

Ví d : hoa lan (Orchidaceae) ụ

Đỉnh sinh trưởng Protocorm Cây → →

Ghép đỉnh chồi (shoot apex grafting) hay vi ghép

-Về nguyên t c, vi ghép là nuôi cắ ấy đỉnh sinh trưởng, nhưng thông qua dinh dưỡng t nhiên c a g c ghép ự ủ ố

- Phương thức này thường dùng để ạ t o ra các giống cây ăn quả sạch bệnh virus nhằm cung c p m t ghép và cành chiấ ắ ết đầu dòng làm nguyên li u nhân giệ ống cho s n xuả ất đại trà

Kỹ thuật vi ghép trên cây có múi theo cách ghép chữ T ngược

- Phương thức này cho phép thu được cây hoàn toàn s ch bạ ệnh và mang đặc điểm di truy n c a cây m cho m t ghép ề ủ ẹ ắ

- Có nhi u cách ghép khác nhau, ch ng h n: (1) Ghép lên m t cề ẳ ạ ặ ắt: đặt m t ghép ắtrực tiếp lên bề mặt lát cắt, trên vùng tượng tầng (2) Ghép ch T ngược: dùng ữđầu nh n cọ ủa lưỡi dao cắt lỗ ghép hình ch T-ữ ngược, chân ch T là m t cữ ặ ắt đểdễ b c lộ ộ vùng tượng tầng (3) Ghép hàm ếch: khoét trên thân m m cách m t cầ ặ ắt 5 mm m t v t lõm hình hàm ch, chi u sâu v t lõm b ng chi u dày l p vộ ế ế ề ế ằ ề ớ ỏ Đặt mắt ghép vào đáy hàm ếch

Các cách ghép đỉnh chồi

b Nuôi c y chấ ồi bất định ( adventitious shoot culture)

- H ệ thống nuôi c y này có nh ng yêu cấ ữ ầu tương tự với nuôi cấy mô phân sinh đỉnh, nó chỉ khác v ngu n m u v t và ngu n g c bề ồ ẫ ậ ồ ố ất định của các chồi mới.Đỉnh ch i bồ ất định m i có th phát tri n ho c tr c tiớ ể ể ặ ự ếp trên m u v t ho c ẫ ậ ặgián ti p t mô callus, mà mô callus này hình thành trên b m t v t c t c a mế ừ ề ặ ế ắ ủ ẫu vật

- M t sộ ố loại m u vẫ ật được dùng như: thuốc lá, cam, chanh, cà chua, b p c i, ắ ảthủy tiên, măng tây, súp lơ,…

13

- S phát sinh ch i bự ồ ất định tr c ti p bự ế ắt đầu b ng các t bào nhu mô ằ ế(parenchyma cells) nằm ở trong bi u bì hoể ặc ngay phía dướ ềi b m t c a thân; ặ ủmột s t bào này tr thành mô phân sinh và các túi nh gố ế ở ỏ ọi là th phân sinh ể(meristemoids) phát triển.

-Chiều hướng phản ứng của thực vật cũng tùy thuộc vào nồng độphytohormone

- Nghiên c u s t o chứ ự ạ ồi ở mô nuôi c y c a cây linh sam Douglas cho thấ ủ ấy cytokinin (BAP 5 M) cμ ần thi t cho s phát sinh ch i bế ự ồ ất định, nhưng có ba kiểu ph n ứng khác nhau có k t qu tùy thu c vào nả ế ả ộ ồng độ ủa auxin đượ c c cung cấp

+ Nồng độ auxin th p (NAA 5 M) ch có ch i phát tri n ấ μ ỉ ồ ể

+ Nồng độ auxin cao hơn (NAA 5 μM) lá m m t o ra c callus và nhi u ch i ầ ạ ả ề ồ+ Khi cung c p ch riêng auxin (NAA = 5 M) thì ch ấ ỉ μ ỉ có callus được tạo thành - S phát tri n các ch i bự ể ồ ất định gián tiếp đầu tiên qua giai đoạn hình thành callus cơ sở (basal callus) từ các chồi được tách trong nuôi cấy Các chồi sau đó phát tri n t ngo i vi mô callus và không có quan hể ừ ạ ệ ban đầu v i các mô có ớmạch dẫn (vascular tissue) c a m u v ủ ẫ ật.

c Nhân giống thông qua giai đoạn callus

- Mục đích nhân giống in vitro n u tái sinh ế được cây hoàn ch nh tr c ti p t ỉ ự ế ừmẫu vật nuôi cấy ban đầu thì không những nhanh chóng thu được cây mà các cây cũng khá đồng nhất về mặt di truyền Tuy nhiên, trong nhiều trường h p mô ợnuôi c y không tái sinh cây ngay mà phát tri n thành kh callus ấ ể ối

- T bào callus khi c y chuy n nhi u l n s không ế ấ ể ề ầ ẽ ổn định v m t di truyề ặ ền Đểtránh tình trạng đó phả ử ụi s d ng lo i callus v a phát sinh, thì hy v ng sạ ừ ọ ẽ thu được cây tái sinh đồng nhất

d Nhân gi ng thông qua phát sinh phôi vô tính- công ngh hố ệ ạt nhân t o ạ

15

trình phát triển và sinh lý, nhưng không có quá trình tái tổ hợp di truyền (genetic recombination) do không ph i là s n ph m c a sả ả ẩ ủ ự thụ tinh gi a giao t ữ ửđực và giao t cái ử

- r t nhiỞ ấ ều cây, người ta nhận thấy các tế bào đang phân chia vô tổ chức đã tạo nên callus khi nuôi c y Có th ấ ể thay đổi hướng phát triển của chúng để tạo ra các phôi vô tính với các bước phát sinh hình thái r t gi ng vấ ố ới trường h p phôi ợhữu tính

- Điểm khác nhau cơ bản gi a phôi h u tính và phôi vô tính là phôi hữ ữ ữu tính luôn luôn đi kèm vớ ội nhũ là cơ quan dựi n trữ năng lượng và chất dinh dưỡng phục v cho quá trình n y m m, còn phôi vô tính hoàn toàn không có nụ ả ầ ở ội nhũ - Khả năng tạo phôi vô tính trong nuôi c y mô th c vấ ự ật, ngoài các điều ki n vệ ật lý, hóa h c thu n l i cho s t o phôi, còn phọ ậ ợ ự ạ ụ thuộc r t l n vào loài, vào các ấ ớ

giống (cultivars), dòng (strains) trong cùng m t loài Khộ ả năng này được ch ng ứminh là do m t ho c m t vài gen ph trách Vì v y, b ng bi n pháp lai t o có ộ ặ ộ ụ ậ ằ ệ ạthể chuy n kh ể ả năng tạo phôi vô tính cao t cây này qua cây khác ừ

Công ngh h t nhân tệ ạ ạo

- H t nhân t o (artificial seed ho c synthetic seed) là phôi vô tính b c trong mạ ạ ặ ọ ột lớp vỏ polymer như agar, agarose, alginate… Trong cấu trúc lưới của các lớp vỏ đó, nước, chất dinh dưỡng và chất sinh trưởng được cung cấp thay cho nội nhũ, giúp cho phôi vô tính có th n y m m tr thành cây hoàn ể ả ầ ở chỉnh

- Do phôi vô tính cũng có thể ả n y m m và phát tri n thành cây hoàn ch nh, nên ầ ể ỉkỹ thu t h t nhân tậ ạ ạo đã được nghiên c u và ng d ng thành công nhiứ ứ ụ ở ều nước - H t nhân t o g m có ba ph n: ạ ạ ồ ầ

• Phôi vô tính

• Vỏ b c polymer (alginate) ọ• Màng ngoài (calcium alginate)

4… và lậ ứ ể ạng không tan trong nướ ế ợp với các ion hóa tr hai (divalent) hoị ặc đa hóa trị polyvalent) như: Ca ( 2+, Mg2+, Al3+,…

e Nhân gi ng trong các n i phố ồ ản ứng sinh học

- Phôi vô tính cà phê được s n xu t thành công Brasil trên các n i phả ấ ở ồ ản ứng sinh h c dung tích t 2-4 lít ọ ừ

- Điểm đáng chú ý trong công nghệ này là thay vì bơm khí vào nồi phản ứng, dịch l ng nuôi cỏ ấy (môi trường mới) được bơm vào nồi và hút ra (môi trường

cũ) theo chu kỳ ngắn, nhờ vậy mô và tế bào thực vật có đủ oxy và chất dinh dưỡng để phát triển mạnh Phương thức nuôi cấy này được gọi là nuôi cấy thể ổn định hóa tính (chemostat culture)

4.3 Các giai đoạn trong quy trình nhân gi ng vô tính in vitro ố

Giai đoạn I – cấy gây

- Đưa mẫu v t t bên ngoài vào nuôi c y vô trùng phậ ừ ấ ải đảm b o nh ng yêu cả ữ ầu sau:

• Tỷ l nhi m th p ệ ễ ấ• Tỷ l s ng cao ệ ố

• Tốc độ sinh trưởng nhanh

- K t quế ả bước c y gây này ph thu c r t nhi u vào cách l y m u Quan trấ ụ ộ ấ ề ấ ẫ ọng nhất vẫn là đỉnh sinh trưởng, chồi nách, sau đó là đoạn hoa tự, hoa, đoạn thân, mảnh lá, rễ…

- Chọn đúng phương pháp khử trùng s cho t l sẽ ỷ ệ ống cao và môi trường dinh dưỡng thích h p s ợ ẽ đạt đượ ốc độ sinh trưởng nhanh c t

M t s dộ ố ạng môi trường dinh dưỡng phổ biến: - Muối khoáng

- Chấ ữu cơ: t h

+ Đường saccharose 1-6 %

+ Vitamin: B1, B6, myo-inositol, nicotinic acid + Amino acid: Arg, Asp, Asp-NH2, Glu, Glu-NH2, Tyr + Phytohormone:

Nhóm auxin: IAA, IBA, NAA, 2,4-D… Nhóm cytokinin: BAP, kinetin, 2-iP, zeatin Nhóm gibberellin: GA 3