Đang tải... (xem toàn văn)
THU NHẬN ENZYME PECTINASE TỪ VI SINH VẬT tài liệu, giáo án, bài giảng , luận văn, luận án, đồ án, bài tập lớn về tất cả...
THU NHẬN ENZYME PECTINASE TỪ VI SINH VẬT Chương I.TỔNG QUAN: I. Bản chất của enzyme pectinase : Enzyme pectinse là một nhóm enzyme thủy phân pectin , sản phẩm của quá trình này là axit galcturonic , galactose , arabinose , methanol … đây là một nhóm ezymw được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp chỉ đứng sau amylase và protease . Enzyme này ban đầu được phát hiện trong các dịch chiết trái cây như cà rốt , cà chua hay đại mạch . Đầu tiên phải kể đến là phất hiện của E.fremi ( 1840 ) trên đối tượng cà rốt . 1) Phân loại và danh pháp quốc tế Enzyme pectinase được chia thành những loại enzyme khác nhau. Việc phân loại enzyme pectinase dực vào tính đặc hiệu , cơ chế tác dụng , kiểi phản ứng , pH tối ưu của enzyme . Năm 1996 , Koller và Neukom chia enzyme pectinase thành hai nhóm chủ yếu : a) Hydrolase : Xúc tác cho quá trình thủy phân bao gồm pectimetylesterase ( pectinehydrolase , mã số EC 3.1.1.11) và polygalacturonase ( plygalacturonit – gluconohydrolase , mã số EC 3.2.1.15 ) : Pectimetylesterase , là các enzyme xúc tác sự thủy phân lien kết este trong phân tử pectine hoặc axit pectinic ( các axit polygalacturonic được este hóa nhờ rượu metylic ở mức thấp). Polygalacturonase , là các enzyme xúc tác sự thủy phân lien kết 1-4 glucozit trong phân tử pectine . Có nhiều polygalacturonase có tính đặc hiệu rất khác nhau : Polymetyl galacturonase tác dụng chủ yếu lên các este metylic của các axit polygalacturonase . Các enzyme này được chia thành hai nhóm : Endo – glucozidaze – polymetylgalacturonase I : Xúc tác sự thủy phân các lên kết gucozit nội mạch của các phân tử axit polygalacturonase được este hóa mức độ cao . Exo- glucozidaze – polymetylgalacturonase III: Xúc tác sự thuỷa phân các lien kết glucozit ở đầu mạch để tách từng gốc axit galacturonic ra khỏi phân tử pectine , bắt đầu từ đầu không khử . Polygalacturonase là các enzyme tác dụng chủ yếu lên các axit pectine ( axit polygalacturonic không bị este hóa ) và các axit polygalactoronic bị este hóa ở mức độ thấp ) . Các enzyme này cũng được chia thành hai nhóm : Endo- glucozide – polygalacturonase II : xúc tác sự thủy oha6n các liên kết glucozit ở giữa mạch của các phân tử axit pectine hoặc axit pectinic . Exo- glucozide – polygalacturonase IV : xúc tác sữ thủy phân các liên kết glucozit ở đầu mạch cùa các phân tử axit hoặc axit pectinic . b) Transeliminase ( TE ) : cũng chia làm hai nhóm pectine – transeliminase và polygalacturonase – transeliminase . Pectine – transeliminase ( PTE ) có tên hệ thống là poly α – 1,4 galacturonit methyleste glucanoliase và có mã số EC.4.2.99.8 nhóm này lại được chia thành hai kiểu : Kiểu I : Endo – pectinetranseliminase viết tắt là endo- PTE- I . Kiểu III : Exo- pectinetranseliminase viết tắt exo -PTE – III. Polygalacturonat -transeliminase(PGTE) có tên hệ thống là poly α – 1,4 D galacturonit glucanoliase và có mã số EC .4.2.99.3 , nhóm enzyme này chia thanh hai kiểu : Kiểu II : Endopolyglacturonat – transeliminase viết tắt exe- PGTE- II Kiểu IV : Exo- polygalacturonat – transeliminase viết tắt exo – PATE- IV . 2) Cấu tạo hóa học và cấu trúc không gian : Enzyme pectinase cũng như hầu hết các enzyme khác là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein , co khả năng xúc tác đặc hiệu cơ chất cao . Các ezyme này thường có cấu trúc rất phức tạp và để đảm bảo tính tác thì chúng có cấu trúc bậc IV . Trong cấu trúc bậc IV hình thành nên trung tâm hoạt động enzyme pectinase chứa một vùng 8-10 vòng xoắn kép. Người ta nhận thấy rằng trung tâm hoạt động chứa 2 axit amin là aspartate va lysine . 3) Pectine và cơ chế tác dụng của enzyme pectinase a. Cấu tạo pectin Pectin là polysaccharide dị thể , chủ yếu là một mạch chính , gồm các gốc axit – α – D – 1,4 galacturonic , liên kết với nhau bằng liên kết 1,4 – O , glucozit ; còn gọi là axit polygalacturonic hay axit pectic . Pectine hòa tan trong tự nhiên là ester metylic của axit pectic , dang tổng quát là : Trong thực tế không phải bao giờ, tất cả các nhóm –COOH ở C6 của đường galacto cũng bị metyl hóa (tạo ester metylic), mà đôi khi một số nhóm –COOH bị decacboxyl hóa (khử CO2), một số nhóm –COOH d9u7o75v thay thế -H bằng kim loại, cũng co lúc giữ nguyên dạng –COOH … Người ta cho rằng protopectine là hợp chất giữa pectine và araban, galacto hay tinh bột. b) Cơ chế tác dụng của enzyme pectinase: Pectinemathyllestarase [mã số E.C.3.1.1.11] là các enzyme xúc tác sự thủy phân lien kết este trong phân tử pectine hay axit pectinic. Khi toàn bộ các nhóm metoxyl đều bị tách ra khỏi cơ chất thì sản phẩm tạo thành là H OH H H OH H COOH OH H H OH H COOH OH H H H OH COOH H OH OO O O O Phân tử axit - polygalacturonic nOH H H OH H COOCH O O O 3 Phân tử ester – metylic của axit pectic OH methanol và các axit polygalacturonic. Sự thủy phân chỉ xảy ra ở các lien kết este trong phân tử pectine và axit polygalacturonic có thể bị thủy phân một phần hoặc hoàn toàn Polygalacturonase [mã số E.C.3.2.1.15] là các enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết 1-4 glucozit trong phân tử pectine.có nhiều polygalacturonase có tính đặc hiệu rất khác nhau: Polymethulgalacturonase: là enzyme tác dụng trên axit polygalacturonic đã được metoxyl hóa.chia làm 2 dạng nhỏ: Endo-glucosidase-polymethylesterase kiểu I xúc tác sự thủy phân liên kết glucozit nội mạch của các phân tử axit polygalacturonic được este hóa ở mức độ cao. Exo-glucosidase-polymethylesterase kiểu III: xt thủy phân liên kết glucozit ở đầu mạch để tách từng gốc axit galacturonic ra khỏi phân tử pectine ,bắt đầu từ không khử .Enzyme nay có ái lực với gốc galacturonic đã metoxyl hóa . Polygalactuironase là các enzyme tácdụng chủ yếu lên các axit pectic(axit polygalacturonic không bị este hóa) và axit pectinic(các axit polygalactironic bị este hóa ở mức độ thấp) và các enzyme này cũng chia thành 2dạng nhỏ : Endo –glucosidase-polygalacturonase kiểu II:xúc tác sự thủy phân liên kết glucozit ở giữa mạch các phân tử axit pectic và axit pectinic. Các enzyme này tác dụng ở vị trí liên kết đầu nhóm cacboxyl tự do. Exo- glucosidase- polygalacturonase kiểu IV: xúc tác sự thủy phân các liên kết glucozit ở đầu mạch của axit pectic và axit pectinic. Enzyme này có ái lực với các liên kết glucozit ở đầu mạch gần với nhóm cacboxyl tự do. Ngoài các enzyme chủ yếu kể trên, tham gia sự phân giải các hợp chất pectine còn có: enzyme protopectinase xúc tác sự thủy pâhn protopectine không tan thành pectine hòa tan và enzyme transeliminase xúc tác sự pâhn cắt các hợp chất pectine bằng con đường khác con đường thủy phân tạo thành galacturonit mạch ngắn hơn với các liên kết kép ở giữa C4 và C5. NGUỒN THU NHẬN Từ thực vật: Pectinase có nhiều trong lá, than, củ và quả thực vật như: củ khoai tây, củ cà rốt, trong quả cafê, quả táo, vỏ cam, vỏ bưởi… nhưng ở thực vật người ta chỉ thấy enzyme pectinsterase. Từ vi sinh vật Nếu ở thực vật người ta chỉ thấy có một loại enzyme thì ở vi sinh vật là một loại enzyme rất phong phú.Vi sinh vật phân giải pectine hầu như có mặt ở các đại diện nấm mốc, nấm men, vi khuẩn như: Nấm mốc: Asp.niger, Asp oryase, Asp.terreus, Asp.saito, Asp.japonicus… Nấm men: sac.ellipsoideus, sac.fragilis, sac.ludwigii … Vi khuẩn: Bac.polymixa, Bac.felseneus, Clostridium roseum… II. Ứng Dụng: Trên thế giới người ta đã sử dụng rộng rãi nhiều enzym khác nhau, trước hết là amilase, protease và pectinase. Riêng pactinase ở Liên xô đã sản xuất 10.7%, ở Mỹ 1.33% so với tổng số enzym đã sản xuất và sử dụng.Đặc biệt ở Mỹ có công ty Rohn and Hoas độc quyền sản xuất pectinase.Ở Pháp có hãng Rapadase sản xuất pectinase ở dạng xirô đóng trong hộp kim lọai hoặc túi polietylen để tiện dùng và xuất khẩu. Nhiều nước cũng sản xuất pectinase từ Asp.niger sử dụng trong sản xuất nước quả Pectinase là tên gọi chung của phức hợp enzym có khả năng phân giải pectin, một gluxit cao phân phân tử chứa nhiều ở thực vật. Pectinase là enzym có ứng dụng lớn thử 3 sau amilase và protease trong công nghiệp, đặc biệt là trong công nghiệp thực phẩm. Nó được dùng nhiều để tăng hiệu suất ép và làm trong dịch quả,rượu quả. Pectinase cũng được sản xuất bột cà phê hòa tan,dễ tách lớp chất nhớt chứa nhiều pectin ở hạt.Pectinase do vi sinh vật tiết ra có tác dụng trong quà trình ngâm đay,gai để dễ tách các sợi xenluloza nhưng không phá hủy sợi. Để tăng số emzym dựa vào sử dụng trong công nghiệp nước ta đồng thời đáp ứng yêu cầu của cơ sở sản xuất, chúng tôi đã nghiên cứu phân lập nhiều chủng nấm mốc có họat tính pectinase từ các nguồn khác nhau và chọn được 1 số chủng Asp.niger có họat tính pectinase cao. Trong số đó đáng chú ý nhất là chủng Asp.niger 72-32. Chế phẩm pectinase thô và tinh thu từ chủng này đã được sử dụng làm trong một số nước quả và để khử pectin trong quá trình trích ly một số dược liệu đông y. 1) Sử dụng pectinase để làm trong nước quả: Xirô quả nhanh đóng cục là do chứa 1 hàm lượng pectinase đáng kể.Qua phân tích hàm lượng pectinase trong 1 số quả như sau: • Cirô mơ:0,107% • Xirô mận:0.153% • Nước mận:0.452% Lượng pectin này làm cho xirô quả bị keo và đục,có độ nhớt khó lọc,nhất là khi quả có độ axit và hàm lượng đường cao như các lọai xirô kể trên. Để làm trong nước trong chúng,nên sử dụng chế phẩm enxyme có họat độ 1,950đvhđ/ 1g canh trường(theo phương pháp Cu-pectat) hoặc 0,768 đvhđ/ 1g canh trường(theo phương pháp so màu). 2) Sử dụng pectinase để trích ly dược liệu đông y: Mục đích để khử pectin có trong dược liệu tạo điều kiện trích lt nội chất nhanh hơn và trích ly sau thời gian bào quản không bị vẫn đục Đựoc liệu đựoc phân phân lọai theo hàm lượng pectin đáng kể: • Nhiều nhất: 51,24% • Ít nhất: 3,8% • Trung bình: 10-30% B.PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY: I.Phương Pháp Nuôi Cấy Bề Mặt: Nuôi cấy nấm mốc và một số vi khuẩn theo phương pháp bề mặt để sản xuất enzim thường dung môi trường rắn, đôi khi dung môi trường lỏng. Môi trường rắn thường là các nguyên liệu tự nhiên:cám mì, cám gạo, ngô mảnh, bột đậu tương… Môi trường lỏng thường là các mật rỉ đường, dịch thủy phân từ thóc mầm, nước bã rượu… có pha thêm muối khoáng. Môi trường lỏng ít dung để nuôi cấy nấm mốc theo phương pháp này. Môi trường rắn thường dùng nhất là cám, đặt biệt trong cám mì có tương đối đầy đủ các chất dinh dưỡng và khi làm ẩm sẽ tạo ra cấu trúc cần thiết cho nấm mốc phát triển, sinh ra nhiều enzim. Muốn nâng cao hoạt tính một số enzim cần thêm vào cám các chất cảm ứng như bã củ cải đường giàu pectin. 1 Năng lượng 350– 426Kcal 7 Tro 6 – 6,5% 2 Nước 12 – 14% 8 Canxi 30 – 32mg 3 Protein thô 10 – 12% 9 Photpho 4,5 – 4,6mg 4 Lipit 20 – 22,7% 10 Sắt 10 – 14mg 5 Gluxit tổng số 40,3 – 42% 11 Vitamin B1 0,96 – 1 mg 6 Cellulose 6,3 – 7% Bảng : thành phần dinh dưỡng của cám Trong nhiều trường hợp, để tạo khả năng thoáng khí tốt hơn, người ta thường cho thêm trấu với lượng khoảng 20 – 30%. Để đảm bảo đủ các chất dinh dưỡng trong môi trường người ta có thể bổ sung nguồn nitơ, photpho, kali hoặc các chất dinh dưỡng (như mầm mạ, nước khoai tây, cao ngô…). Môi trường rắn cần được làm ướt tới độ ẩm 60%. Độ ẩm 58 – 60% là độ ẩm tương đối thích hợp với nhiều mốc nuôi bề mặt trên khay hở, nếu độ ẩm trên 60% vi khuẩn dễ dàng phát triển, dễ gây tạp nhiễm, khó thông khí, còn trường hợp độ ẩm môi trường là 45 – 50% thì khi nuôi cấy môi trường sẽ khô nhanh, sinh bào tử mạnh và làm giảm hoạt tính của enzim tạo thành. Trong thời gian nuôi cấy nên giữ độ ẩm của môi trường ở 50 – 60%, muốn vậy độ ẩm không khí phòng nuôi cần khỏang 90 – 100%. Trong sản xuất cần phải thanh trùng môi trường rắn ở 1 – 1,5 atm bằng hơi nóng trong 45 – 60’. Nếu môi trường trước khi thanh trùng được trộn với axit clohydric hoặc sunfuric đến pH thích hợp, hay thêm một ít focmalin họăc một chất sát trùng khác thì chỉ cần thanh trùng dưới áp lục hơi 0,2 – 0,3atm. Thêm axit giữ môi trường ở pH nhất định sẽ giúp cho một vài enzim tạo thành được nhiều hơn. Môi trường được trải mỏng ra các khay đã được thanh trùng với lớp dày khoảng 2 – 2,5cm và để nguội đến 30*C thì tiến hành cấy giống. Giống được nhân giống cũng theo phương pháp bề mặt họăc bằng bào tử thu được theo phương phát tách bào tử khỏi môi trường nhân giống và chứa vào các bình nút kín hoặc trong các túi PE. Khi nuôi cấy nhân giống thường để cho mốc mọc già đến khi sinh ra nhiều bào tử. Tỉ lệ nhân giống vào khỏang 0,2 – 2%. Mỗi gam bào tử mốc có thể cấy vào 10kg môi trường. Các khay có môi trường đã cấy mốc được đặt vào phòng nuôi có sẳn các giá. Phòng nuôi có thể điều chỉnh được nhiệt độ, độ ẩm và được thổi gió. Nhiệt độ thích hợp với đa số mốc là 30 – 32*C. nến nhiệt độ xuống dưới 24*C nấm mốc phát triển chậm, sinh bào tử yếu, thời gian nuôi cấy dài dẫn đến làm giảm khả năng sinh tổng hợp enzim. Qúa trình nuôi cấy nấm mốc trên bề mặt môi truờng được chia thành 3 thời kì: 1) Khoảng 10 – 14h đầu: bào tử trương nở bắt đầu nảy mầm. Thời kì này chưa hình thành enzim, không đòi hỏi phải thông khí nhiều chỉ cần làm thoáng khoảng 2 – 3 thể tích không khí / thể tích phòng / giờ. Giống rất nhạy cảm với nhiệt độ ở giờ này, nhiệt độ buồng nuôi cần giữ ở 29 – 31*C. 2) Thời kì giữa léo dài khoảng 14 – 18h: mốc phát triển nhanh, hô hấp mạnh, sợi nấm có thể quan sát bằng mắt thường, lúc đấu là lớp long tơ màu trắng – xám và ngày càng rõ, làm môi trường kết bánh lại. Có thể phải lật môi trường, bẻ nhỏ ra để sợi nấm mọc tốt hơn. Các chất dinh dưỡng trong môi trường tiêu hao nhanh để phục vụ cho các quá trình trao đổi chất trong tế bào và giống hô hấp mạnh tỏa ra môi trường chung quanh 80 – 90kcal/giờ. Làm nhiệt độ môi trường có thể tăng lên đến 37 – 40*C hoặc lâu hơn nữa. Thời kì này cần phải thông khí mạnh tới 60 thể tích khí/1thể tích phòng/giờ để cung cấp O2 cho mốc thở và đuổi CO2 ra khởi môi trường, đồng thời làm giãm nhiệt độ buồng nuôi. Nhiệt độ buồng nuôi ở giai đoạn này cần giữ ở 28 – 29*C và độ ầm trong vòng khoảng 100%. 3) Thời kì thứ 3 kéo dài trong khoảng 10 – 20h: Thời gian này các quá trình trao đổi chất vẫn tiếp tục nhưng yếu dần, lượng nhiệt tạo ra giảm và việc tạo thành enzim của tế bào vẫn tiếp tục. lượng nhiệt tỏa ra khoảng 15 – 30kcal/kg/giờ. Thông khí không quá 20 – 25 thể tích không khí/thể tích phòng/giờ, giữ nhiệt độ buồng nuôi ở 30*C. Tùy thuộc vào đặc tính sinh lí của từng giống mốc, thời gian nuôi cấy có thể kết thúc tại điểm mà lượng enzim tạo thành tối đa. Môi trường sau khi nuôi cấy được sấy khô tới độ ẩm dưới 12%, nghiền nhỏ, đựng trong các bao polyetylen hoặc giấy chống ẩm. Sản phẩm này là chế phẩm enzim thô. II.Phương Pháp Nuôi Cấy Chìm: Trong nhiều môi trường nuôi cấy chìm, nguồn cacbon thường là tinh bột, các loại bột khác nhau, đôi khi còn dung một số nguyên liệu khác nữa. Các nguồn nitơ hữu cơ thường dung là cao ngô, nước chiết từ mầm mạ, dịch tự phân nấm men… Nhưng khi cho thêm các chất này phải thận trọng, vì hỗn hợp các axitamin sẽ có tác dụng nâng cao sinh tổng hợp amylaza ở Asperrgillus, nhưng lại có tác dụng xấu đối với các enzim khác. Thành phần khoáng trong môi trường cũng có ý nghĩa to lớn. Trong môi trường nuôi cấy A.oryzae 3 – 9 – 15 có tinh bột và nitrat, cần phải thêm MnSO 4 . khi không thêm MnSO 4 mốc phát triển bình thường, nhưng amylaza hòan toàn không tạo thành, vì trong thành phần phân tử amylaza có chứa những axit amin mang lưu hùynh và mangan. Môi trường được thanh trùng trong thiết bị riêng hoặc trong thùng lên men dưới áp lực của hơi nóng trực tiếp ở 118 – 125*C trong khoảng 45 – 60’. Sau khi làm nguội môi trường đến nhiệt độ thích hợp sẽ tiến hành tiếp giống. Giống được cấy từ ống nghiệm qua các bình tam giác, đặt trên máy lắc, rồi nuôi ở thùng nhân giống có thể tích bằng 5- 10% thể tích thùng lên men trong khoảng 24 – 36h. Cấy giống mốc bào tử theo phương pháp chìm sẽ kéo dài thời gian nảy mầm và cũng kéo dài toàn bộ quá trình nuôi cấy. Môi trường nhân giống có thể dung các hợp chất nitơ dễ tiêu hóa đối với vi sinh vật mà trong quá trình nuôi cấy vẫn nâng cao được họat lục sinh tổng hợp. Tỷ lệ giống nằm trong khoảng 2 – 5%, nhưng đối với một số chủng tỷ lệ này cón giảm hơn nhiều, có khi tới 0,5 – 0,6%. Sinh tổng hợp enzim theo phương pháp chìm trong các thùng lên men có khí thổi và khuấy liên tục kéo dài trong khoảng 2 – 4ngày. Đa số các enzim thủy phân do nấm mốc, xạ khuẩn tạo thành được vào môi trường xung quanh, phần còn lại trong hệ sợi sau 3ngày nuôi cấy khoảng 10 – 15%. Sơ đồ công nghệ của việc nuôi cấy vi sinh vật theo phương pháp chìm trong sản xuất enzim về nguyên lí giống như quá trình sản xuất các chế phẩm sinh học khác (axit amin, vitamin, chất kháng sinh …). Quá trình tách chế phẩm sau khi lên men có thể khác nhau, nhưng quá trình lên men với các thiết bị và qui định về theo dõi các chế độ lên men là rất giống nhau. Trong quá trình nuôi cấy nấm mốc sinh enzim theo phương pháp chìm pH môi trường có một ý nghĩa rất lớn. Chỉ số pH thích hợp cho sinh tổng hợp pectinase là 7 – 8. Trong môi trường khi dùng các muối amon làm nguồn nitơ môi trường sẽ bị kiềm hóa. Để điều chỉnh pH trong quá trình nuôi cấy người ta dùng NaOH và H 2 SO 4 . Sự súc khí không những ảnh hưởng đến sinh trưởng của vi sinh vật mà còn ảnh hưởng đến sự tạo thành enzim. Ảnh hưởng của chất cảm ứng và nguốn cacbon Nhóm enzyme pectinase một mặt là các enzyme bản thể, nhưng mặt khác cũng là các enzyme cảm ứng.Do đó, một trong những yếu tố quan trọng của sự sinh tổng hợp enzyme pectinase là phải có cơ chất đặc hiệu.Ví dụ pectine được thêmvào môi trường sẽ cảm ứng để tổng hợp h65 enzyme pectinase. Ảnh hưởng của nguồn nitơ Nguồn nitơ cũng có vai trò rất quan trọng trong sự tăng tổng hợp enzyme pectinase bởi vi sinh vật. Người ta thêm nitơ vào môi trường dưới dạng muối nitrat và muối amôn. Ảnh hưởng của các yếu tố khác Ngoài cacbon và nitơ,các yếu tố vô cơ cũng ảnh hưởng tới sự sinh tổng hợp các enzyme pectinase của vi sinh vật. Trong đó phốt pho là cấu tử vô cơ cần thịết của môi trường.Nói chung hàm lượng phốt pho trong môi trường phải không được ít hơn 8- 10 mg (tính theo %) Các yếu tố khác như pH của môi trường nuôi cấy, nhiệt độ nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy … đều ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp enzyme pectinase. C.TÁCH VÀ LÀM SẠCH CHẾ PHẨM ENZIM TỪ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY BỀ MẶT: I.TÁCH VÀ LÀM SẠCH: Để chiết rút enzim từ môi trường rắn người ta dùng nước, các dung dịch muối trung tính, các dung môi hữu cơ (cồn, axeton). Nhiều kết quả thí nghiệm cho thấy dùng nước trong mục đích này có kết quả tốt và dể được dùng rộng rãi trong sản xuất. Theo phương pháp khuếch tán bằng nước có thể chiết được lượng enzim trên 90 – 95% và trong nước chiết không chứa các tạp chất không tan. Nước thường dung khuếch tán ở nhiệt độ 25 – 28*C. Để tránh tạp nhiễm nên thêm vào nước một ít focmalin hoăc chất sát trùng khác. Dịch chiết thu được có màu nâu sẫm, khá trong, chứa 10 – 15% chất khô hòa tan và được làm lạnh kịp thời xuống 10 – 12*C. Phương pháp tách chiết và làm sach enzim được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay là phương pháp kết tủa enzim bằng dung môi hữu cơ (etanol, izopropanol và axeton). Các dung môi hữu cơ này làm giãm hằng có điện môi của môi trường. như ta đã biết, lực hút tĩnh điện tỉ lệ nghịch với hằng số điện mới. vì vậy các enzim, các chất protein cũng như các chất có phân tử thấp trong hệ dung dịch nước – dung môi hữu cơ sẽ tủa và lắng xuống. Độ hòa tan cùa enzim vào dung dịch cồn – nước phụ thuộc vào nồng độ cồn, nhiệt độ, lực hút ion của dung dịch và tính chất protein của enzim. Để tránh mất họat tính của enzim tất cả phải được làm lạnh xuống 3 – 5*C. khi trộn phải khuấy mạnh, khi các enzim kết tủa và lắng xuống dưới cần tách ly ngay. SƠ ĐỒ TINH SẠCH ENZYME TỪ CANH TRƯỜNG NẤM MỐC II.XÁC ĐỊNH HỌAT ĐỘ ENZYME: 1) Phương pháp nhớt kế: Xác định độ họat đông pectinase của canh trường theo phương pháp độ nhớt của dung dịch pectin 1% bằng nhớt kế Ot-van. 2) Phương pháp đông chung(Cu-pectat): Nguyên tắc: thủy phân pectin dưới tác dụng pectinase.Sau đó dùng CuS0 4 5% để kết tủa axit pectin dưới dạng đồng pectat(Cu- pectat).Hòa tan kết tủa bằng NH 4 OH 25%. Xác địng lượng đồng nhờ iốt. Một đơn vị họat động pectinase theo phương pháp này là một lượng emzym có khả năng xúc thủy phân hết 1 mg pectin trong thời gian 1giờ ở điều kiện tiêu chuẩn. 3) Phương pháp so màu: Theo phương pháp này:Một đơn vị họat động pectinase là một lượng emzym có khả năng xúc thủy phân xác định họat độ pectinase Canh trường nấm mốc (nuôi theo phương pháp bề mặt) Khuấy trộn Trích ly lọcBã xác định họat độ pectinase Cô đặc Kết tủa bằng ethanol Ly tâm Sấy khô xác định họat độ pectinase Bảo quản [...]... chuẩn 4) D .THU CHẾ PHẨM TỪ ASP.NIGER 72-32: I Thành phần với môi trường thích hợp để chủng Asp.Niger cho pectinase cao 1) Ảnh hưởng thời gian nuôi: Để nghiên cứu ảnh hưởng này Asp.niger được nuôi cấy trên môi trường có độ ẩm 50% và nuôi ở nhiệt độ 30oC trong khỏang từ 30-40 giờ.Sau 2 giờ xác định họat độ pectinase của canh trường.Kết quả thu được ghi ở bảng 3 Qua bảng 3 thấy sự sinh tổng hợp pectinase. .. 2 giờ xác định họat độ pectinase của canh trường Kết quả thu được trình bày ở bảng 4 Bảng 4.Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi đến sinh tổng hợp pectinase của Asp.niger 72-32 Nhiệt độ Họat Động pectinase( đvhđ/1g canh nuôi(oC) trường) 28 803 30 1134 32 1351 34 1688 36 764 48 520 Qua bảng 4 thấy nhiệt độ từ 30-32oC là thích hợp nhất cho sinh tổng hợp pectinase của Asp.niger 72-32 3) Ảnh hưởng độ ầm ban đầu... tahy đổi từ 4065% và nuôi ở 32oC Sau 36 giờ xác định họat độ pectinase của canh trường Kết quả thu được ghi rõ ở bảng 5 Bảng 5 Ảnh hưởng đô ẩm ban đầu của môi trường đến sinh tổng hợp pectinase của Asp.niger 72-32 Họat Động pectinase( đvhđ/1g canh Độ ẩm ban đầu trường) 40 481 45 731 50 957 55 1355 60 897 65 638 Qua bảng 5 thấy độ ẩm ban đầu của môi trường có ảnh hưởng rõ rệt đến sự hình thành pectinase. .. giờ đem xác định họat độ pectinase của canh trường Kết quả thu được ghi ở bảng 6,7 Qua bảng 6 và 7 thấy rằng khi thêm vào môi trường nguyên liệu chưa pectin thích hợp họat động pectinase của Asp.niger 72-32 tăng rõ rệt từ 8-12 lần Họat độ pectinase tăng nhiều nhất(gần 12 lần) khi trong môi trường có 11% carốt, sau đó đến của cải 12% và bã táo 13%.Điều này chứng tỏ một lần nữa pectinase là một enzim cảm... pectinase là một enzim cảm ứng.Ngòai ra cà rốt còn chứa một lượng muối vô cơ và vitamin có thể ảnh hưởng tốt đến quá trình sinh trưởng phát triển và sinh tổng hợp enzym của nấm mốc Bảng 6 Ảnh hưởng của hàm lượng và nguồn nguyên liệu chứa pectin khác nhau đến sinh tổng hợp pectinase của Asp.niger 72-32(hương pháp đồng) Họat Động pectinase( đvhđ/1g canh Lượng nguyên trường) liệu chứa Môi trường Môi trường... pectinase của nấm mốc trên môi trường có cà rốt 11% Khi thêm từ 12.5%amon sufat họat độ pectinase của chùng Asp.niger có thể tăng từ 7- 10% Bảng 8 Ảnh hưởng của amon sunfat đến sinh tổng hợp pectinase của Asp.niger 72-32 Hàm lượng Thời gian chảy(s) của dung dịch pectin qua nhớt kế Tỷ lệ tăng họat độ (NH4)2S04 Ôt-van trong các thí nghiệm pectinase % trong môi trường (%) 1 1.5 2 2.5 3 1 17 16.5 16 15.6... Vì vậy nghiên cứ ảnh hưởng của vi c cho thêm muối (NH4)2SO4 vào môi trường Asp.niger 7232 được nuôi cấy trên môi trường cơ bản có chứa 11% cà rốt với hàm lượng muối amon sunfat thay đổi, nuôi ở 32 oC và sau 36 giờ đem xác định họat độ pectinase của canh trường.Kết quả thu được ghi ở bảng 8 Qua bảng 8 nhận thấy muối amon sunfat trong môi trường có ảnh hưởng đến tổng hợp pectinase của nấm mốc trên môi... mạnh mẽ từ giờ thứ 32 trở đi và đạt cực đại vào giờ thứ 36.Sau đó giảm dần Bảng 3.Ảnh hưởng thời gian nuôi đến sinh tổng hợp pectinase của Asp.niger 7232 Họat Động pectinase( đvhđ/1g Thời gian nuôi canh trường) 30 361 32 740 34 1150 36 1300 38 887 40 288 2) Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi: Asp.niger 72-32 được nuôi cấy trên môi trường cơ bản có độ ẩm 50% ở nhiệt đô khác nhau Sau 2 giờ xác định họat độ pectinase. .. chủng sinh tổng hợp pectinase cao: a) Cám gạo 64% b) Trấu nhỏ 21,5% c) Bột cà rốt 11% d) Muối (NH4)2SO4 2,5% e) Độ ẩm ban đầu 55% 2) Điều kiện Tối ưu: a) Thời gian nuôi 36 giờ b) Nhiệt Độ nuôi 30-320C III Thu chế phẩm pectinase: Tùy theo nghiên cứu và sử dụng chế phẩm ở các dạng khác nhau : • Dạng thô (canh trường nấm mốc) • Dạng hơi thô( dịch tiết canh trường) • Dạng tương đối tinh(kết tủa protein -enzyme) ... sấy khô(sấy chân không ở 40oC) để dùng hoặc xử lý theo sơ đồ trên để thu chế phẩm enzyme tinh Giá trị tối ưu để trích ly và kết tủa enzyme như sau: • Tì lệ nước chiết 1:4(tức nước 4 phần,1 phần chế phẩm thô) • Nồng độ NaCl để trích ly là 0.1-0.2 % • Thời gian khuấy trộn để trích ly từ 20-30 phút • Tỷ lệ etanol 1:2.5(tức là 1 nước chiết enzyme cho 2.5 etanol độ cồn 9096o)… 0 7.8 9.25 10.01 10.32 6.6 TÀI . THU NHẬN ENZYME PECTINASE TỪ VI SINH VẬT Chương I.TỔNG QUAN: I. Bản chất của enzyme pectinase : Enzyme pectinse là một nhóm enzyme thủy phân pectin , sản phẩm của quá trình này là axit galcturonic. ta chỉ thấy enzyme pectinsterase. Từ vi sinh vật Nếu ở thực vật người ta chỉ thấy có một loại enzyme thì ở vi sinh vật là một loại enzyme rất phong phú .Vi sinh vật phân giải pectine hầu như có. công nghệ của vi c nuôi cấy vi sinh vật theo phương pháp chìm trong sản xuất enzim về nguyên lí giống như quá trình sản xuất các chế phẩm sinh học khác (axit amin, vitamin, chất kháng sinh …). Quá