Đang tải... (xem toàn văn)
Recombinant human follicle stimulating hormone rhFSH. Folliclestimulating hormone (FSH): Ở người, được tổng hợp và tiết ra ở tuyến yên trước Ở nữ, Kích thích sự phát triển của nang noãn Ở nam, Đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh tinh In vitro fertilization Có trong thành phần quan trọng của thuốc kích trứng ở nữ và kích thích sự sinh tinh ở nam
Recombinant Recombinant human human follicle follicle stimulating stimulating hormone hormone rhFSH rhFSH Nội dung I II III IV V VI VII Giới thiệu phân lập gen mã hóa rhFSH Lựa chọn dịng tế bào biểu Lựa chọn vector biểu Đưa gen đặc tính vào vector biểu Chuyển vector vào tế bào CHO-44 nuôi cấy Tách tinh chế rhFSH Bảo quản rhFSH Giới thiệu PL gen mã hóa rhFSH Follicle-stimulating hormone (FSH): Ở người, tổng hợp tiết tuyến yên trước Ở nữ, Kích thích phát triển nang noãn In vitro fertilization Ở nam, Đóng vai trị quan trọng q trình sinh tinh Có thành phần quan trọng thuốc kích trứng nữ kích thích sinh tinh nam Giới thiệu PL gen mã hóa rhFSH Giới thiệu PL gen mã hóa rhFSH Những gen mã hóa cho tiểu đơn vị α β rhFSH lấy từ thư viện DNA tế bào gan thai nhi người Gen mã hóa cho tiểu đơn vị α nằm 6q14.3 Gen mã hóa cho tiểu đơn vị β nằm 11p13 Lựa chọn dòng tế bào biểu Lựa chọn dòng tế bào biểu Chinese Hamster Ovary (CHO) cell lines Dễ nuôi cấy & suất cao Promoter mạnh HT biến đổi sau dịch mã tương đồng với người Các công cụ kỹ thuật gen tối ưu cho CHO cell lines Được chấp nhận FDA Lựa chọn vector biểu Lựa chọn vector biểu α-FSH cDNA vào pCMV6-XL4 β-FSH cDNA vào pCMV6-XL5 Lựa chọn vector biểu Chuyển vector vào tế bào CHO-DG44 Cytogenetic appearance of FSH expression vector in metaphase spread of CHO/dhfr- genome White arrows indicate the integration site of recombinant construct at transfected cells Nuôi cấy tế bào CHO – DG44 Điều kiện nuôi cấy Môi trường nuôi cấy huyền phù với 0,18% Pluronic F-68 + 4mM L- Glutamine + 250 mM MTX Nhiệt độ: 37 ℃, độ ẩm: 80%, CO2: 8% Tốc độ quay 130 rpm, thể tích bình 123 mL Thay đổi mơi trường sau 3-4 ngày Thu hoạch sau 23-32 ngày Chu kỳ nuôi cấy: tháng Xác định mật độ tỷ lệ tế bào sống công cụ Vi-Cell XR (Beckman Coulter, Fullerton, CA), mật độ phù hợp cho nuôi cấy : 2.5 – 4.0 × 10^6 cells/ml Ni cấy tế bào CHO – DG44 Nuôi cấy tế bào CHO – DG44 Năng suất Năng suất tạo rh FSH từ ni cấy dịng tế bào động vật khác sử dụng hệ thống vector biểu khác là: 0.5–1.5 pg/cell/day ( Sản xuất thương mại ) Ngay sử dụng ni cấy dịng tế bào CHO + HT vector khác cho kết hạn chế: khoảng 0.32 pg/cell/day ( cho có khả biểu cao) CHO-DG44/dhfr- + Bicistronic vector : lên tới 12.3±1.7 pg/cell/day Tách tinh chế rhFSH Loại bỏ tế bào (Ly tâm) Xử lý dịch môi trường ni cấy (Lọc với màng có cut off 10kDa) Loại bỏ hầu hết tạp chất Sắc ký trao đổi Anion (Capture step) Sắc ký kỵ nước Loại bỏ tạp chất phân tử nhỏ, cô đặc, Sắc ký kỵ nước Nanofiltration ultrafiltration & thay đổi buffer polishing Xác định hoạt tính protein Xác định khối lượng phân tử MS hấp phụ laser • • Kích thước tiểu đơn vị alpha: ~ 14kDa Kích thước tiểu đơn vị Beta: ~ 17kDa Sử dụng điện di gel SDS-PAGE Xác định hoạt tính protein Xác định monosacharides Sử dụng sắc ký trao đổi ion hiệu cao Xác định hoạt tính protein Xác định Cấu trúc cacbonhydrate Sử dụng MALDI TOF MS Cấu trúc carbonhydrate rhFSH tính heterogeneous heavily sialated so với u-hFSH Xác định hoạt tính protein Xác định Vị trí gốc Glycolysation Sử dụng LC- MS phù hợp với FSH tự nhiên gốc Asn 52 78 tiểu đơn vị alpha gốc Asn 24 tiểu đơn vị beta Xác định hoạt tính protein So sánh hoạt tính in Vivo Hoạt tính in vivo rhFSH kiểm tra cách tăng trọng lượng buồng trứng thỏ tác giả Steelman & Pohley Sử dụng NIBSC 92/642 tiêu chuẩn đối chiếu quốc tế Xác định hoạt tính protein Thử nghiệm lâm sàng Bảo quản rhFSH Nồng độ rhFSH đo phương pháp Bradford Assay Bảo quản rhFSH Đơn vị liều lượng 0.5 mL(300 IU) 0.75 mL (450 IU) 1.5 mL (900 IU) Thành phần công thức Bảo quản rhFSH Thời gian bảo quản Có thể lên tới 24 tháng THANK YOU FOR LISTENING ... Bảo quản rhFSH Giới thiệu PL gen mã hóa rhFSH Follicle-stimulating hormone (FSH): Ở người, tổng hợp tiết tuyến yên trước Ở nữ, Kích thích phát triển nang nỗn In vitro fertilization... 23-32 ngày Chu kỳ nuôi cấy: tháng Xác định mật độ tỷ lệ tế bào sống công cụ Vi-Cell XR (Beckman Coulter, Fullerton, CA), mật độ phù hợp cho ni cấy : 2.5 – 4.0 × 10^6 cells/ml Ni cấy tế bào CHO – DG44... tính protein Xác định khối lượng phân tử MS hấp phụ laser • • Kích thước tiểu đơn vị alpha: ~ 14kDa Kích thước tiểu đơn vị Beta: ~ 17kDa Sử dụng điện di gel SDS-PAGE Xác định hoạt tính protein